核酸扩增装置及核酸扩增方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供即使使用不具有耐热性的核酸合成酶也可以高效地进行ＰＣＲ，核酸合成酶可以再利用，可以提升规模，而且扩增的核酸的分离.纯化容易的核酸扩增装置及核酸扩增方法。向具有使核酸的分子内和／或分子间形成的双链解链变性为单链状态的区域和使该双链解链了的核酸再次形成双链的复性区域的流路中导入至少含有作为模板的核酸、作为引物的核酸、磷酸化合物和金属离子的反应液，在所述变性区域使所述作为模板的核酸的分子内和／或分子间形成的双链解链变性为单链状态后，在所述复性区域使该双链解链了的作为模板的核酸和作为引物的核酸之间形成双链，同时通过被固定在所述复性区域内的核酸合成酶进行核酸合成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用PCR法的，更具体涉及在内部具有至少一条流路，在该流路中导入至少含有作为模板的核酸、作为引物的核酸、磷酸化合物和金属离子的反应液，通过被固定在该流路内的核酸合成酶进行核酸的扩增的。
技术介绍
PCR(聚合酶链式反应)法被广泛应用于微量的模板DNA的高效的复制·扩增。PCR法是通过多次重复以下的循环来扩增目标DNA的方法，其1个循环包括将作为模板的双链DNA热变性成单链DNA的步骤；在得到的单链模板DNA上分别与互补的引物退火的步骤；通过具有耐热性的DNA聚合酶作用，由引物进行互补链合成，从而合成双链DNA的步骤。上述各步骤通过控制反应液的温度和反应时间进行，通常，作为模板的双链DNA热变性成单链DNA在约94℃下进行，在单链DNA上将引物退火在约55℃下进行，通过DNA聚合酶的互补链的合成在约72℃下进行。以往，作为自动执行PCR法的装置，已知有通过以下方法进行反应的装置将含有模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶等的反应液加入Eppendorf型试管中，将该试管插入设置于铝制部件上的孔中，用加热器和冷却器改变该铝部件的温度。然而，上述PCR法需要在高精度的温度控制下进行热循环，如上述的分批式的反应中随着规模的增大，反应体系的热的波动变得显著，所以规模的提升存在极限。因此，作为在高精度的温度控制下进行热循环、而且可以提升扩增量的PCR法，在下述专利文献1和下述非专利文献1中揭示了流式PCR法。该流式PCR法是通过向设置有加热部和冷却部的流路输入含有DNA聚合酶、模板DNA、引物DNA、dNTP等的反应液来进行热循环，从而进行PCR的方法。此外，下述专利文献2中揭示了以下的核酸序列的扩增方法，它是用于扩增核酸序列的方法，其特征在于，包含(a)将作为模板的核酸通过DNA聚合酶和与该核酸的碱基序列实际互补的至少1种引物进行处理，合成与该模板互补的引物延伸链的步骤；其中，该引物是含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合体寡聚核苷酸引物，为了用核酸内切酶剪切，该核糖核苷酸配置在该引物的3’末端或3’末端一侧；(b)将(a)步骤中得到的双链核酸的引物延伸链的含有核糖核苷酸的部位用核酸内切酶剪切的步骤；和(c)自(b)步骤中得到的被切去引物延伸链的双链核酸的引物部分的3’端，通过具有链转移活性的DNA聚合酶使与模板互补的核酸序列延伸，从而进行链转移的步骤。若采用该方法(ICAN法)，可以不进行热循环而扩增DNA，所以可以使用不具有耐热性的酶，而且没有热的波动引起的反应规模的限制。专利文献1日本专利特开平6-30776号公报专利文献2日本专利特开2003-70490号公报非专利文献1《Science》(1998年)280号5366卷，1046-1048页(Kopp MU，Mello AJ，Manz A.著)专利技术的揭示本专利技术要解决的问题然而，上述分批式的PCR法、上述专利文献1和上述非专利文献1所述的PCR法在使双链模板DNA变性为单链DNA时需要加热，因此需要使用具有耐热性的特殊的DNA聚合酶，存在无法使用普遍存在的不具有耐热性的DNA聚合酶的缺点。此外，上述专利文献2所揭示的方法中，使用RNA和DNA的嵌合体引物作为引物，需要使用在DNA双链解链的同时合成DNA的exo-Bca DNA聚合酶和剪切在嵌合体引物上新延伸的DNA与嵌合体引物RNA的连接点的核糖核酸酶H等特殊的酶，所以存在成本升高的缺点。另外，上述以往的方法中反应生成物中混有DNA聚合酶等核酸合成酶，因此不仅扩增的DNA的纯化麻烦，而且昂贵的核酸合成酶几乎无法再利用。因此，本专利技术的目的在于提供不仅是使用具有耐热性的核酸合成酶、即使使用不具有耐热性的核酸合成酶也可以连续、高效地进行PCR，核酸合成酶可以再利用、连续地使用，而且扩增的核酸的分离·纯化容易，还可以提升规模的。解决课题的方法为了达成上述目的，本专利技术的核酸扩增装置是在内部具有至少一条流路，在该流路中流过至少含有作为模板的核酸、作为引物的核酸、磷酸化合物和金属离子的反应液，在该流路内扩增核酸的核酸扩增装置；其特征在于，所述流路同时具有变性区域和复性区域，所述变性区域内进行使所述作为模板的核酸的分子内和/或分子间形成的双链解链的变性反应，所述复性区域内使所述双链解链的作为模板的核酸和所述作为引物的核酸形成双链，核酸合成酶被固定于所述复性区域。若采用本专利技术的核酸扩增装置，则在具有上述变性区域和复性区域的至少一条的流路内导入至少含有作为模板的核酸、作为引物的核酸、磷酸化合物和金属离子的反应液进行核酸合成反应时，被固定在上述复性区域的上述核酸合成酶不会受到使作为模板的核酸解链而变性成单链状态时的加热等的影响，所以核酸合成酶的失活受到抑制，即使使用不具有耐热性的核酸合成酶也可以连续地进行PCR。此外，上述核酸合成酶是固定的，所以不仅可以容易地进行扩增了的核酸的分离·纯化，而且上述核酸合成酶可以再利用、连续地使用，反应规模的提升也是容易的。本专利技术中，提到核酸的情况下，其含义包含天然型和非天然型的两类核酸。本专利技术的核酸扩增装置中，较好是具有可以加热上述变性区域、并且将上述复性区域保持在比上述变性区域低的温度的温度控制部件。若采用这种方式，可以连续、高效地进行由以下步骤构成的一系列的PCR循环通过加热使具有在分子内和/或分子间形成的双链的作为模板的核酸解链，变性为单链状态的步骤；在所述比变性区域的温度低的环境下，在得到的该双链解链了的作为模板的核酸和分别互补的引物之间形成双链的步骤；在所述比变性区域的温度低的环境下，使其与核酸合成酶作用，由引物进行互补链合成的步骤。此外，较好是所述核酸合成酶被固定在珠粒上，该珠粒至少被填充在所述复性区域内。若采用这种方式，可以使固定的核酸合成酶与反应液高效地接触，所以能够提高反应效率。或者，上述核酸合成酶也可以至少被固定在所述复性区域的内壁表面。若采用这种方式，可以简单地形成固定化核酸合成酶的流路。即，形成这样的流路时，首先可以使核酸合成酶固定化在流路的整个表面而形成整个流路，通过这种方式，即使变性区域的酶失活，复性区域的酶仍保持活性状态，所以可以容易地形成所需的流路。另外，在上述流路内较好是交互地设置上述变性区域和上述复性区域。若采用这种方式，则可以进行多次PCR循环，所以能够高效地扩增目标核酸。本专利技术的核酸扩增装置中，上述核酸合成酶可以使用在30～40℃的温度具有最适温度的酶。若采用这种方式，则可以扩大核酸合成酶使用的选择范围，选择以往的PCR中无法使用的较经济的酶。此外，还可以同时使用除一般的核酸合成酶外的其他的酶。因此，通过同时使用以往进行PCR时难以同时使用的酶、例如纠正合成了的核酸的错配的酶等，可比以往的PCR提高扩增的可靠性。此外，本专利技术的核酸扩增装置中，上述流路可以具有循环流路，而且该循环流路具有上述复性区域和上述变性区域的结构。在这里，循环流路是指用于使反应液循环、并交替通过该循环流路内的变性区域和复性区域的流路，是上述流路在规定的位置分支、该分支的流路再互相连接的、具有环状结构的流路或者上述流路的整体具有一个或多个环状结构的流路，利用该环状结构的流路流动液体的一部分或全部流过环状结构进行循环。若采用这种方式，则可以在使作为模板的本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸扩增装置，它是在内部具有至少一条流路，在该流路中流过至少含有作为模板的核酸、作为引物的核酸、磷酸化合物和金属离子的反应液，在该流路内扩增核酸的的核酸扩增装置，其特征在于，所述流路同时具有变性区域和复性区域，所述变性区域内进行所述 作为模板的核酸的分子内和／或分子间形成的双链解链的变性反应，所述复性区域内所述双链解链的作为模板的核酸和所述作为引物的核酸形成双链，核酸合成酶被固定于所述复性区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：萩原直人，
申请(专利权)人：太阳诱电株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]