一种农杆菌介导的无抗生素筛选转基因大麦植株的方法，其步骤包括引物设计、ＰＣＲ扩增、载体构建、遗传转化、筛选鉴定转基因植物，其特征在于，通过农杆菌介导将ｍａｎＡ基因导入受体大麦中，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过鉴定磷酸甘露糖异构酶活性和ＰＣＲ检测，筛选获得转基因植株，其制备步骤如下： １）设计一对特异引物：ＰＭＩＰ１：５’－ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＴＡＡＣＴＣＡ－３’和ＰＭＩＰ２：５’－ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＣＧ－３’，扩增大肠杆菌ｍａｎＡ基因，以该基因为选择标记基因构建植物表达载体，转化根癌农杆菌； ２）在愈伤组织诱导培养基上诱导大麦幼胚，得到愈伤组织； ３）将步骤２）的愈伤组织转移至预培养培养基上培养５小时； ４）将步骤３）的愈伤组织与农杆菌共培养，将共培后的愈伤组织依次转移至恢复、筛选、分化和生根培养基上培养，筛选获得到候选转基因植株； ５）用氯酚红显色法检测候选转基因植株，并将所筛选的候选转基因植株移栽成苗； ６）进一步用ＰＣＲ鉴定移栽后的转基因植株，获得转基因植物； 其中： 步骤２）所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方制备： ＭＳ２愈伤组织诱导培养基：ＫＮＯ↓［３］ １９００ｍｇ／Ｌ，ＮＨ↓［４］ＮＯ↓［３］ １６５０ｍｇ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ １７０ｍｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ ３７０ｍｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］·２Ｈ↓［２］Ｏ ４４０ｍｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ ２７．８ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］·ＥＤＴＡ ３７．３ｍｇ／Ｌ，ＫＩ ０．８３ｍｇ／Ｌ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］ ６．２ｍｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ↓［４］·４Ｈ↓［２］Ｏ ２２．３ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ ８．６ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］·２Ｈ↓［２］Ｏ ０．２５ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ↓［４］·５Ｈ↓［２］Ｏ １．２５ｍｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ↓［２］·６Ｈ↓［２］Ｏ ０．０２５ｍｇ／Ｌ，甘氨酸 ２ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ１］ １ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ６］ ０．５ｍｇ／，Ｖ↓［Ｂ５］ ０．５ｍｇ／Ｌ，脯氨酸 ６９０ｍｇ／Ｌ，肌醇 ２５０ｍｇ／Ｌ，水解酪蛋白 １０００ｍｇ／Ｌ，２，４－Ｄ ２ｍｇ／Ｌ，麦芽糖 ３０ｇ／Ｌ，琼脂 ６ｇ／Ｌ，补充水分至１Ｌ，ｐＨ５．８； 步骤３）所述的培养基按以下配方制备： ＭＳ３预培养培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，附加甘露醇７２．８ｇ／Ｌ，ｐＨ５．８； 步骤４）所述的培养基按以下配方制备： ＭＳ４共培养培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，附加乙酰丁香酮１００μｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ５．８； ＭＳ５恢复培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，附加头孢霉素５００ｍｇ／Ｌ，ｐＨ５．８； ＭＳ６筛选培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，将其中的麦芽糖３０ｇ／Ｌ修改为１０ｇ／Ｌ，附加甘露糖２０ｇ／Ｌ，ｐＨ５．８； ＭＳ７分化培养基：以ＭＳ２为基本培养基，附加头孢霉素３００ｍｇ／Ｌ，同时除去２，４－Ｄ ２ｍｇ／Ｌ，ｐＨ５．８； ＭＳ８生根培养基：ＫＮＯ↓［３］ ９５０ｍｇ／Ｌ，ＮＨ↓［４］ＮＯ↓［３］ ８２５ｍｇ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］ ８５ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ １８５ｍｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］·２Ｈ↓［２］Ｏ ２２０ｍｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ １３．９ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］·ＥＤＴＡ １８．６５ｍｇ／Ｌ，Ｋｌ０．４１５ｍｇ／Ｌ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］ ３．１ｍｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ↓［４］·４Ｈ↓［２］Ｏ １１．１５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ ４．３ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］·２Ｈ↓［２］Ｏ ０．１２５ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ↓［４］·５Ｈ↓［２］Ｏ ０．６２５ｍｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ↓［２］·６Ｈ↓［２］Ｏ ０．０１２５ｍｇ／Ｌ，甘氨酸 ２ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ１］ ０．５ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ６］ ０．５ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ５］ ０．５ｍｇ／Ｌ，脯氨酸 ６９０ｍｇ／Ｌ，肌醇 ２５０ｍｇ／Ｌ，水解酪蛋白 １０００ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ １ｍｇ／Ｌ，麦芽糖 １０ｇ／Ｌ，甘露糖 ２０ｇ／Ｌ，头孢霉素 ２００ｍｇ／Ｌ，琼脂６ｇ／Ｌ，补充水分至１Ｌ，ｐＨ５．８。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转基因
，具体涉及利用农杆菌介导的无抗生素筛选培育大麦转基因植株的方法。本专利技术还涉及到PMI(磷酸甘露糖异构酶)/甘露糖筛选体系在人麦遗传转化中的应用，以及氯酚红(CPR)显色法在鉴别大麦转基因植物中的应用。
技术介绍
大麦是世界上最古老的作物之一，是列于小麦、玉米和水稻之后第四位重要的禾谷类作物，主要用作饲料、食粮、啤酒工业原料以及近年引起关注的医药工业原料和保健食品。大麦也是遗传学研究广泛应用的模式植物之一。自1997年Tingay等首次以农杆菌介导法转化大麦成功以来，农杆菌介导的转化方法成为近年来大麦遗传转化中最常用的一种方法(Tingay S，McElroy D，Kalla R，Fieg S，Wang M，Thornton S&Brettell R.Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation.J Plant，1997，111369-1376；McCormac A C，WuH，Bao M，Wang Y，Xu R，Elliott M C&Chen D F.The use of visual marker genes as cell-specific reporters ofAgrobacterium-mediated T-DNA delivery to wheat(Triticum aestivum L.)and Barley(Hordeum vulgare L.).Euphytica，1998，9917-25；Matthews P R，Wang M B，Waterhouse P M，Thornton S，Fieg S J，Gubler F，JacobsenJ V.Marker gene elimination from transgenic barley，using co-transformation with adjacent‘twinT-DNAs’on a standard Agrobacterium transformation vector.Mol Breeding，2001，7195-202；Murray F，BrettellR，Matthews P，Bishop D，Jacobsen J.Comparison of Agrobacterium-mediated transformation of four barleycultivars using the GFP and GUS reporter genes.Plant Cell Rep，2004，22397-402；Wu H，McCormac A C，ElliottM C & Chen D F.Agrobacterium-mediated stable transformation of cell suspension cultures of barley(Hordeumvulgare L.).Plant Cell Tiss.Org.Cult，1998，54161-171；Trifonova A，Madsen S，Olesen A.Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barley under a range of in vitro culture conditions.Plant Sci，2001，161871-880；Fang Y D，Akula C，Altpeter F.Agrobacterium-mediated barley(Hordeum vulgareL.)transformation using green fluorescent protein as a visual marker and sequence analysis of the T-DNA::barleygenomic DNA junctions.J Plant Physiol，2002，159113l-1138；Travella S，Ross S M，Harden J，Everett C，Snape J W，Harwood W A.A comparison of transgenic barley lines produced by particle bombardment andAgrobacterium-mediated techniques.Plant Cell Rep，2005，23780-789；Kumlehn J，Serazetdinova L，Hensel G，Becker D，Loerz H.Genetic transformation of barley(Hordeum vulgare L.)via infection of androgenetic pollencultures withAgrobacterium tumefaciens.Plant Biotechnol J，2006，4251-261；等等)。Tingay等采用的方法是用基因枪先轰击愈伤组织，再将具有细小伤口的愈伤组织作为农杆菌转化的受体。虽然其具有转基因低拷贝、遗传稳定等优点，但也加大了实验难度和提高了实验成本。同时，在大麦的农杆菌介导转化中，目前存在的突出问题就是受基因型限制、转化频率不高以及筛选标记单一。在实际工作中，必须改进现有技术体系的缺陷和不足。本专利技术从愈伤组织培养和转化程序入手，并通过PMI/甘露糖筛选体系在大麦遗传转化中的应用，进一步克服愈伤组织在转化过程中由于长时间的筛选继代影响分化的问题，从而建立一种高效的农杆菌介导的大麦遗传转化方法。PMI/甘露糖筛选系统对人体和环境安全、筛选试剂价格低廉、不影响转化植株的生长发育、筛选效率高。氯酚红(CPR)显色法是利用植物进行甘露糖代谢会使培养基酸化的原理。pH指示剂氯酚红在pH6.0时呈红色，随着pH下降转变成黄色。该方法是PMI活性检测的最常用方法，在转基因小麦、玉米和甜橙检测上均有应用(Boscariol R L，Almeida WA B，Derbyshire M T V C，Mour o Filho F A A，Mendes B M J.Theuse of the PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants(Citrus sinensis L.Osbeck).Plant Cell Rep，2003，22122-128；Wright M，Dawson J，Dunder E.Efficient biolistic transformation of maize(Zea mays L.)and wheat(Triticum aestivum L.)using the phosphomannose isomerase gene，pmi，as the selectablemarker.Plant Cell Rep，2001，20429-436；Gao Z，Xie X，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种农杆菌介导的无抗生素筛选转基因大麦植株的方法，其步骤包括引物设计、ＰＣＲ扩增、载体构建、遗传转化、筛选鉴定转基因植物，其特征在于，通过农杆菌介导将ｍａｎＡ基因导入受体大麦中，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过鉴定磷酸甘露糖异构酶活性和ＰＣＲ检测，筛选获得转基因植株，其制备步骤如下：１）设计一对特异引物：ＰＭＩＰ１：５’－ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＴＡＡＣＴＣＡ－３’和ＰＭＩＰ２：５’－ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＣＧ－３’，扩增大肠杆菌ｍａｎＡ基因，以该基因为选择标记基因构建植物表达载体，转化根癌农杆菌；２）在愈伤组织诱导培养基上诱导大麦幼胚，得到愈伤组织；３）将步骤２）的愈伤组织转移至预培养培养基上培养５小时；４）将步骤３）的愈伤组织与农杆菌共培养，将共培后的愈伤组织依次转移至恢复、筛选、分化和生根培养基上培养，筛选获得到候选转基因植株；５）用氯酚红显色法检测候选转基因植株，并将所筛选的候选转基因植株移栽成苗；６）进一步用ＰＣＲ鉴定移栽后的转基因植株，获得转基因植物；其中：步骤２）所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方制备：ＭＳ２愈伤组织诱导培养基：ＫＮＯ↓［３］１９００ｍｇ／Ｌ，ＮＨ↓［４］ＮＯ↓［３］１６５０ｍｇ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］１７０ｍｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ３７０ｍｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］·２Ｈ↓［２］Ｏ４４０ｍｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ２７．８ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］·ＥＤＴＡ３７．３ｍｇ／Ｌ，ＫＩ０．８３ｍｇ／Ｌ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］６．２ｍｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ↓［４］·４Ｈ↓［２］Ｏ２２．３ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ８．６ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］·２Ｈ↓［２］Ｏ０．２５ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ↓［４］·５Ｈ↓［２］Ｏ１．２５ｍｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ↓［２］·６Ｈ↓［２］Ｏ０．０２５ｍｇ／Ｌ，甘氨酸２ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ１］１ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ６］０．５ｍｇ／，Ｖ↓［Ｂ５］０．５ｍｇ／Ｌ，脯氨酸６９０ｍｇ／Ｌ，肌醇２５０ｍｇ／Ｌ，水解酪蛋白１０００ｍｇ／Ｌ，２，４－Ｄ２ｍｇ／Ｌ，麦芽糖３０ｇ／Ｌ，琼脂６ｇ／Ｌ，补充水分至１Ｌ，ｐＨ５．８；步骤３）所述的培养基按以下配方制备：ＭＳ３预培养培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，附加甘露醇７２．８ｇ／Ｌ，ｐＨ５．８；步骤４）所述的培养基按以下配方制备：ＭＳ４共培养培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，附加乙酰丁香酮１００μｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ５．８；ＭＳ５恢复培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，附加头孢霉素５００ｍｇ／Ｌ，ｐＨ５．８；ＭＳ６筛选培养基：以ＭＳ２培养基为基本培养基，将其中的麦芽糖３０ｇ／Ｌ修改为１０ｇ／Ｌ，附加甘露糖２０ｇ／Ｌ，ｐＨ５．８；ＭＳ７分化培养基：以ＭＳ２为基本培养基，附加头孢霉素３００ｍｇ／Ｌ，同时除去２，４－Ｄ２ｍｇ／Ｌ，ｐＨ５．８；ＭＳ８生根培养基：ＫＮＯ↓［３］９５０ｍｇ／Ｌ，ＮＨ↓［４］ＮＯ↓［３］８２５ｍｇ／Ｌ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］８５ｍｇ／ＬＭｇＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ１８５ｍｇ／Ｌ，ＣａＣｌ↓［２］·２Ｈ↓［２］Ｏ２２０ｍｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ１３．９ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］·ＥＤＴＡ１８．６５ｍｇ／Ｌ，Ｋｌ０．４１５ｍｇ／Ｌ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］３．１ｍｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ↓［４］·４Ｈ↓［２］Ｏ１１．１５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ↓［４］·７Ｈ↓［２］Ｏ４．３ｍｇ／Ｌ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］·２Ｈ↓［２］Ｏ０．１２５ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ↓［４］·５Ｈ↓［２］Ｏ０．６２５ｍｇ／Ｌ，ＣｏＣｌ↓［２］·６Ｈ↓［２］Ｏ０．０１２５ｍｇ／Ｌ，甘氨酸２ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ１］０．５ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ６］０．５ｍｇ／Ｌ，Ｖ↓［Ｂ５］０．５ｍｇ／Ｌ，脯氨酸６９０ｍｇ／Ｌ，肌醇２５０ｍｇ／Ｌ，水解酪蛋白１０００ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ１ｍｇ／Ｌ，麦芽糖１０ｇ／Ｌ，甘露糖２０ｇ／Ｌ，头孢霉素２００ｍｇ／Ｌ，琼脂６ｇ／Ｌ，补充水分至１Ｌ，ｐＨ５．８。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉才，李和平，王韬，黄涛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83
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