【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒检测领域，具体涉及用于检测鳜蛙虹彩病毒的rpa-lfd引物和探针、试剂盒及应用。
技术介绍
1、病毒性疾病对鳜鱼养殖业造成了重大损失，感染鳜的病毒主要有传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,isknv)、鳜蛙虹彩病毒(mandarinfish ranav irus,mrv)和鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus,scrv)等，其中以鳜传染性脾肾坏死病的危害最大，其次是鳜蛙虹彩病毒。鳜蛙虹彩病毒属于虹彩病毒科(iridovirida e)蛙病毒属(ranavirus)，鳜蛙虹彩病毒会隐性存在于鳜鱼体内，一旦鱼体免疫力低下，则极易暴发鳜蛙虹彩病毒病，因此，对鳜蛙虹彩病毒进行早期现场检测对于鳜蛙虹彩病毒病的防控至关重要。
2、目前，对鳜蛙虹彩病毒的检测主要是采用针对主衣壳蛋白(mcp)基因的pcr或荧光定量pcr检测方法。梁红茹等建立了可同时检测传染性脾肾坏死病毒、鳜蛙虹彩病毒和鳜弹状病毒的三重pcr检测方法，灵敏度较高，对三种病毒的检测限均为10pg/μl。此外，还有基于鳜蛙虹彩病毒多克隆抗体的免疫组化和免疫荧光的检测方法。但这些方法对检测条件要求高，仅适用于实验室检测，难以应用于渔场快速检测。目前能用于渔场快速检测鳜蛙虹彩病毒的方法为鳜蛙虹彩病毒抗体胶体金检测试纸条，可以全血或血清为样本快速检测鳜蛙虹彩病毒，但抗体检测灵敏度较低，不能完全替代核酸检测。
3、重组酶聚合酶扩增(recomb
4、但rpa还不是一项完美的技术，尤其是与lfd结合后，反向引物与探针之间的非特异性结合导致的假阳性问题尤为突出。众所周知，lfd检测线捕捉的是具有双标记的目的扩增产物，倘若带有生物素的反向引物与带有荧光基团的探针发生配对结合，就会形成“伪双标记产物”，使lfd的检测线上显示假阳性信号。由于rpa反应温度低，尽管严格按照rpa设计原则来筛选引物和探针，在天然序列里设计引物序列，出现引物二聚体仍是一种不可避免的现象，且rpa-lfd仅靠是否有显色条带来评判结果，不能像琼脂糖凝胶电泳法那样通过产物片段大小来区分阳性结果。因此，经过扩增效率筛选后的反向引物和探针序列，仍需要进行序列修改以消除反向引物-探针带来的假阳性现象，如点突变。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供用于检测鳜蛙虹彩病毒的rpa-lfd引物和探针组合。
2、本专利技术的另一个目的在于提供了上述引物和探针组合在制备鳜蛙虹彩病毒检测试剂盒中的应用。
3、为达到上述技术目的，本专利技术采取以下技术措施：
4、一种用于检测鳜蛙虹彩病毒的rpa-lfd引物探针组合，所述rpa-lfd引物对序列如表1中的seq id no.1和seq id no.2所示，其中反向引物mcp-mr的5’端连接有biotin；所述探针的序列如表1中的seq id no.3所示，其中探针的5’端标记羧基荧光素fam，3’端添加延伸阻断基团c3 spacer，探针序列的第33位不为碱基，为四氢呋喃。
5、表1.鳜蛙虹彩病毒rpa-lfd试剂盒所用的引物和探针序列
6、
7、本专利技术的保护范围还包括：
8、一种鳜蛙虹彩病毒检测试剂盒，包括上述引物和探针组合。
9、以上所述的试剂盒，优选的，所述的试剂盒包括双微球体系，一次性稀释液和核酸检测试纸条；
10、所述的双微球体系：微球1包含rpa-lfd引物和探针组合、结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶；微球2包含再水化缓冲液和乙酸镁溶液。
11、优选的，以上所述微球1中包含10μmol/l的正向引物、10μmol/l的反向引物、5μmol/l的探针；
12、以上所述的试剂盒的非诊断性检测方法，包括：
13、s1、提取待测样品的核酸；
14、s2、将步骤s1所提取的核酸滴加50μl至双微球体系中，混匀后可立即启动反应，得到扩增产物；
15、s3、用一次性稀释液稀释扩增产物后，以核酸检测试纸条分析步骤s2得到的扩增产物。
16、进一步地，在步骤s3中，使用核酸检测试纸条对扩增产物进行分析：试纸条上的质控线(c)和检测线(t)同时出现条带为阳性；试纸条质控线(c)出现条带，而检测线(t)没有条带则为阴性；若质控线(c)无条带则反应无效。
17、上述引物和探针组合在制备鳜蛙虹彩病毒检测试剂盒中的应用。
18、与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：
19、1)节约时间：pcr完成一次反应至少需要扩增60分钟及以上，而rpa扩增时间为30分钟以内，甚者10分钟即可达到试纸条检测的核酸浓度，极大缩短了核酸扩增的时间。
20、2)降低反应温度：rpa在35～45℃恒温条件下即可完成实验，该温度远远低于pc r的60～95℃。
21、3)方法简单便于携带：扩增所需要的酶、rpa-lfd引物探针组合和缓冲液等皆已做成冻干微球，扩增时只需要向双微球体系内加入提取的核酸，混匀后即可启动反应。本专利技术的检测方法对操作人员专业要求低，适用于渔场现场检测，也可用于mrv的科学研究。
22、4)特异性强：本专利技术试剂盒中添加了探针序列，增加了检测的特异性。
23、5)灵敏度高且可肉眼判读：直接肉眼观察试纸条显色情况，检测线和质控线均显色就可定性判断为mrv阳性，且灵敏度与分子检测实验室广泛使用的pcr相当，甚至更高。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.用于检测鳜蛙虹彩病毒的RPA-LFD引物和探针组合，为下述引物对和探针：
2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备鳜蛙虹彩病毒的RPA-LFD检测试剂盒中的应用。
3.一种鳜蛙虹彩病毒的RPA-LFD检测试剂盒，包括权利要求1所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括双微球体系，一次性稀释液和核酸检测试纸条；
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述微球1中包含10 μmol/L的正向引物、10 μmol/L的反向引物、5 μmol/L的探针。
6.权利要求4所述的试剂盒的非诊断性检测方法，包括：
7.根据权利要求6所述的方法，使用核酸检测试纸条对扩增产物进行分析的判定方法是：试纸条上的质控线（C）和检测线（T）同时出现条带为阳性；试纸条质控线（C）出现条带，而检测线（T）没有条带则为阴性；若质控线（C）无条带则反应无效。
【技术特征摘要】
1.用于检测鳜蛙虹彩病毒的rpa-lfd引物和探针组合，为下述引物对和探针：
2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备鳜蛙虹彩病毒的rpa-lfd检测试剂盒中的应用。
3.一种鳜蛙虹彩病毒的rpa-lfd检测试剂盒，包括权利要求1所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括双微球体系，一次性稀释液和核酸检测试纸条；
5. 根据权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张旭杰，张永安，范炜淇，荣克明，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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