一种新的青霉素G酰化酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新型的青霉素Ｇ酰化酶及其编码序列。该青霉素Ｇ酰化酶基因组成型表达，不必苯乙酸诱导，苯乙酸对该基因的表达有抑制作用；该青霉素Ｇ酰化酶基因的表达对低温度的依赖也有所减弱，其最适的产酶温度是２８℃。本发明专利技术还提供了该青霉素Ｇ酰化酶的制法和用途。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及新的黄杆菌青霉素G酰化酶及其编码序列。本专利技术还涉及此青霉素G酰化酶的制法和用途。
技术介绍
青霉素G酰化酶在碱性条件下催化青霉素G水解生成母核(6-APA)和侧链苯乙酸，母核6-APA是半合成青霉素的原料；在酸性条件下催化母核6-APA和侧链苯乙酸生成青霉素G。因此青霉素G酰化酶是半合成青霉素工业生产中一种非常重要的酶。青霉素G酰化酶多存在于细菌，酵母甚至真菌中。青霉素G酰化酶是由一个无活性的前体肽经过剪切加工，形成有活性的由大小不同的二个亚基组成的分子量在80KD左右的异源二聚体。青霉素G酰化酶基因的表达无论是在原始菌株或者是重组的大肠杆菌中都受到许多因素的调节。青霉素G酰化酶基因的表达对温度很敏感，在高于33℃条件下生长时，表达的蛋白大多为没有活力的前体，22-25℃是产酶的最好温度。但是22℃情况下菌体的生长量较低，因此总酶活不高。工业上为了提高总酶活，采取变温处理，在28℃下培养菌体，然后在转移到22℃产酶，这给工业生产带来不便。另外，许多来源的青霉素G酰化酶基因的表达都必须有苯乙酸的诱导，在这些青霉素酰化酶基因的内部存在调节基因，调节基因编码阻遏蛋白抑制青霉素G酰化酶基因的表达。只有在培养基中加入苯乙酸，通过苯乙酸和阻遏蛋白结合，从而使得青霉素G酰化酶基因得以表达。由于苯乙酸有较强的酸性，对菌体的生长存在抑制作用，苯乙酸也产生较强的气味，因此给工业生产带来许多不便。因此，本领域迫切需要开发新的青霉素G酰化酶，所述的青霉素G酰化酶的基因表达不依赖于苯乙酸的诱导和/或所述青霉素G酰化酶的基因表达对低温的依赖性也下降。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的青霉素G酰化酶蛋白以及其片段、类似物和衍生物。所述的青霉素G酰化酶基因的表达不依赖于苯乙酸的诱导，并且所述青霉素G酰化酶基因表达对低温的依赖性也下降。本专利技术的另一目的是提供编码所述青霉素G酰化酶的多核苷酸。本专利技术的另一目的是提供生产所述青霉素G酰化酶的方法以及该多肽和编码序列的用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种分离的青霉素G酰化酶，它包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，所述的青霉素G酰化酶，所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；且所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核昔酸序列编码本专利技术的青霉素G酰化酶。较佳地，该多核苷酸编码含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的α亚基和含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的β亚基。更佳地，该多核苷酸的序列含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。在本专利技术的第三方面，提供了一种含有本专利技术上述的多核苷酸的载体。在本专利技术的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本专利技术上述的载体，或者含有青霉素G酰化酶的编码序列。在一优选例中，上述的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli.)JM109/pPGACGMCC No.0745。在本专利技术的第五方面，提供了一种青霉素G酰化酶的制备方法，该方法包含(a)在适合表达青霉素G酰化酶的条件下，培养本专利技术上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出青霉素G酰化酶。在本专利技术的第六方面，提供了一种生产青霉素G的方法，它包括步骤(a)在酸性条件下，在反应体系中，用青霉素G酰化酶催化青霉素母核6-APA与侧链苯乙酸形成青霉素G，所述的青霉素G酰化酶包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)从反应体系中分离出青霉素G。在本专利技术的第七方面，提供了一种生产青霉素母核6-APA的方法，它包括步骤 (a)在碱性条件下，在反应体系中，用青霉素G酰化酶催化青霉素G分解形成母核6-APA与侧链苯乙酸，所述的青霉素G酰化酶包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)从反应体系中分离出青霉素母核6-APA。附图说明下列附图用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术范围。图1显示了青霉素G酰化酶催化的反应。图2显示了带有本专利技术青霉素G酰化酶基因的质粒。图3A和3B分别显示了本专利技术青霉素G酰化酶的DNA和氨基酸序列，其中箭头处为α亚基和β亚基的切割位点，切割后前半部分为α亚基，后半部分为β亚基。图4显示了纯化的本专利技术青霉素G酰化酶的电泳照片。具体实施例方式本专利技术人经过深入而广泛的研究，分离出了一种新型的青霉素G酰化酶基因。该青霉素G酰化酶基因呈组成型表达，不必苯乙酸诱导，而且，该青霉素G酰化酶基因的表达对低温度的依赖也有所减弱，其最适的产酶温度是28℃。在此基础上完成了本专利技术。在本专利技术中，术语“青霉素G酰化酶蛋白”、“青霉素G酰化酶多肽”或“青霉素G酰化酶”可互换使用，都指由青霉素G酰化酶α亚基(氨基酸序列如SEQ IDNO2所示)和β亚基(氨基酸序列如SEQ ID NO4所示)构成的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的青霉素G酰化酶”是指青霉素G酰化酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化青霉素G酰化酶蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本专利技术的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本专利技术的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本专利技术还包括黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本专利技术的天然黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本专利技术的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本专利技术中，术语“黄杆菌青霉素G酰化酶”还包括具有与黄杆菌青本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的青霉素Ｇ酰化酶，其特征在于，它包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物； 所述的β亚基含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜卫红，赵国屏，杨蕴刘，朱颂成，
申请(专利权)人：中国科学院上海植物生理研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]