双基因共表达质粒、构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种同时含Ｄ－氨基酸氧化酶基因和戊二酰－７－氨基头孢烷酸酰化酶基因的双基因共表达质粒。该质粒是通过基因重组的方法，使戊二酰－７－氨基头孢烷酸酰化酶基因（ａｃｙ）与Ｄ－氨基酸氧化酶基因（ｄａａｏ）置于同一个启动子或分别在各自的启动子的调控下获得。该质粒转化大肠杆菌得到基因工程菌如ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．０５３３、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．０５３４，可应用于直接转化头孢菌素Ｃ生成７－氨基头孢烷酸（７－ＡＣＡ）。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体的说是基因间共表达调控序列、DNA重组和质粒转化合适的宿主细胞等基因工程学，以及通过基因工程学方法重组的双基因共表达质粒的用途。7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是半合成头孢类抗生素的母核，在临床医药的生产中具有重要的应用价值。使用生物转化法取代传统的化学法裂解头孢菌素C(cephalosporin C，CPC)生产7-ACA的工艺路线，由于具有反应条件温和，不接触有毒有害化学药品和溶剂，无环境污染等优点，其研究一直受到产业界与学术界的共同重视。生物转化CPC生成7-ACA的过程，分为一步酶法与两步酶法两种(见图1)，其中一步酶法，即用CPC酰化酶催化CPC脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链，直接生成产物7-ACA的方法，步骤简单，可使反应一步完成，是生产中最理想的工艺路线。然而，四十余年来，从自然界中分离得到的催化该反应的CPC酰化酶，活力均十分低，远不能达到工业化生产的要求，尚无工业化应用的可能。两步酶法，是指使用不同微生物来源的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAO)和戊二酰-7-氨基酸头孢烷酸酰化酶(glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase，GA)分两步对CPC进行转化，最终生成7-ACA。首先，CPC被DAO酶促氧化脱氨，生成相应的α-酮基-己二酰-7ACA(α-keto-adipyl-7-aminocephalosporanic acid，AKA-7ACA)和H2O2，AKA-7ACA再在H2O2的作用下非酶促氧化脱羧，生成戊二酰-7-ACA(glutaryl-7-aminocephalosporanicacid，GL-7ACA)。而后，经GA催化，水解GL-7ACA的戊二酰基侧链生成7-ACA。该法在当前7-ACA的工业生产中，是切实可行的工艺路线。然而如图所示，因微生物中的过氧化氢酶对H2O2的破坏活性而对转化反应产生干扰。早在1994年，魏中荻等设计了利用产DAO的三角酵母和产GA的基因工程菌细胞在同一反应器内直接转化CPC为7-ACA的酶法转化过程(CN专利申请号94112285.9)，但需使用叠氮化钠等有毒物质抑制过氧化氢酶活力。随着GL-7ACA酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)先后被克隆(杨蕴刘等，生物工程学报，1991；刘洪波等，生物工程学报，15(3)，337-342，1999)，以及适合应用于CPC转化反应的基因工程宿主菌E.coli MMR204和E.coli D11的成功构建(CN 98110964.0，1998年；CN 98122876.3，1998年)，利用产双酶的基因工程菌细胞，直接转化CPC为7-ACA已成为可能。将两菌二次发酵变为单菌一次发酵，并使双反应罐的两步酶反应在单一反应罐中一步完成，达到简化产酶菌的发酵和酶促转化工艺之目的。本专利技术的目的之一是提供一种同时含D-氨基酸氧化酶基因和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因的双基因共表达质粒。本专利技术的目的之二是提供上述共表达质粒的构建方法。本专利技术的目的之三是提供上述共表达质粒的用途。本专利技术的双基因共表达质粒是一种包含戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)的质粒，结构如下所示 ，式中，n＝0或1，P＝0或Not I，R＝EcoR I或HindIII；(daao-acy)m两个基因相连接的顺序及其多变体可以按多聚体形式存在于质粒中，其中m＝1-3。当n＝0，P＝Not I，R＝EcoR I时，所述重组质粒为pMSS，结构式是 ，该质粒转化大肠杆菌后可得到含双基因共表达质粒的菌种，该菌种已于2001年1月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏号为No.0533，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；当n＝1，P＝0，R＝HindIII时，所述重组质粒为pMSTO，结构式是 ，该质粒转化大肠杆菌可得到含双基因共表达质粒的菌种，该菌种已于2001年1月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其简称为CGMCC，保藏号为No.0534，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。上述重组质粒转化的宿主菌可以是大肠杆菌E.coli JM109、E.coli MMR204或E.coli D11等。本专利技术采用基因重组的方法，使戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)置于同一个启动子或分别在各自的启动子的调控下，获得双基因共表达质粒，该双基因共表达质粒转化大肠杆菌得到基因工程菌后，接种于培养基并经生长培养，可同时表达DAO与GA的活力。下面通过六个方面对本
技术实现思路
进行详细阐述，即重组质粒pMSS与pMSTO的构建、表达方法及其应用于对CPC的转化。本专利技术所涉及的研究材料见表1表1菌株与质粒 重组质粒pMSS的构建本专利技术提供一种新的重组质粒pMSS，它是双链环状DNA，长度为8.2kb。它的构建过程如图2所示。我们设计将daao及acy基因重组到一个DNA载体质粒上，以使同一个基因工程菌细胞中同时产生DAO与GA两种酶，使得转化CPC生成7-ACA的两步酶反应能在同一细胞中一步完成。为此，我们利用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别消化含acy基因的质粒pKKCAIS，并将所得acy基因片断与经同样酶切的载体质粒pET28b相连，得到重组质粒pMST。接着再用限制性内切酶NheI和NotI将acy基因片断从pMST上切下，与经SpeI和NotI酶切，含dao基因的重组质粒pJL相连。由于经NheI和SpeI酶切的末端可以互补，经T4DNH连接酶催化的连接反应，acy基因片断被插入到pJL中，并位于daao基因的下游，与daao基因串联，该两基因的转录均处于trc启动子控制之下。重组质粒pMSTO的构建本专利技术提供一种新的重组质粒pMSTO，它是双链环状DNA，长度为8.3kb，它的构建过程如图3所示。在本工作1项构建所得重组质粒pMSS中，由于acy基因距离trc启动子较远，由trc启动子控制的acy基因的表达可能偏弱。因此，在重组质粒pMSTO的构建设计中，使daao和acy基因分别受各自的启动子所控制。先用NdeI与NotI将acy基因从质粒pMST上切下，与经同样酶切的载体pALTER-Ex1相连，使acy基因插入pALTER-Ex1中tac启动子下游部位。再用HindIII将acy基因连同tac启动子一齐切下，与经同样酶切的受体质粒pJL相连，使tac启动子和acy基因插在daao基因下游，得到重组质粒pMSTO。重组质粒pMSS、pMSTO在E.coli MMR204中的表达分别用pMSS与pMSTO质粒DNA转化E.coli MMR204，转化子经纯化后接种于LB液体培养基(组成成分为胰胨0.5％、酵母粉1.0％、NaCl1％，PH7.0)，37℃振摇培养过夜，再以1％接种量移种到装60mlLB的500ml三角瓶中，继续于37℃振摇培养，6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含戊二酰－７－氨基头孢烷酸酰化酶基因（ａｃｙ）与Ｄ－氨基酸氧化酶基因（ｄａａｏ）的双基因共表达质粒，结构如下所示： ＊＊＊，式中，ｎ＝０或１，Ｐ＝０或ＮｏｔⅠ，Ｒ＝ＥｃｏＲⅠ或ＨｉｎｄⅢ。

【技术特征摘要】
1.一种包含戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因(acy)与D-氨基酸氧化酶基因(daao)的双基因共表达质粒，结构如下所示 ，式中，n＝0或1，P＝0或Not I，R＝EcoR I或HindIII。2.如权利要求1所述的双基因共表达质粒，其特征是具有如下结构式3.如权利要求1所述的双基因共表达质粒，其特征是具有如下结构式4.如权利要求2所述的双基因共表达质粒，其特征是该质粒转化大肠杆菌得到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.0533。5.如权利要求3所述的双基因共表达质粒，其特征是该质粒转化大肠杆菌得到大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.0534。6.如权利要求1所述的双基因共表达质粒，其特征是(daao-acy)m两个基因相连接的顺序及其多变体可以按多聚体...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨蕴刘，朱彤波，张益棻，姜卫红，陈军，焦瑞身，
申请(专利权)人：中国科学院上海植物生理研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]