淋病快速诊断药盒及其生产工艺制造技术

本发明专利技术涉及疾病诊断试剂及其生产工艺，包括药盒试剂的总体配备；淋病双球菌抗原筛选、分离与纯化，免疫淋球菌抗体制备和提纯工艺。药盒经临床试用具有较高的特异性和敏感性，通过检测血清，３０分钟左右即可作出诊断，且阳性检出率高；药盒生产工艺流程简洁，分离纯化方法温和，对膜蛋白破坏性低，回收得率高，所得淋球菌蛋白抗原纯度达电泳级，反应活性较原粗菌液提高５００－１０００倍，药盒价格仅国际已有产品１／１０。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术淋病快速诊断药盒及其生产工艺，涉及疾病诊断试剂及其生产工艺。淋病(Gonor rhea)即淋菌性尿道炎，是由淋病双球菌侵袭男性前尿道，女性尿道或子宫颈等处引起的泌尿生殖系统粘膜的炎症性疾病，占所有性传播性疾病(STD)的70-80％。淋病对人类的危害是众所周知的，淋球菌主要侵袭粘膜组织，不仅引起尿道炎症，导致尿频、尿痛、脓血尿，炎症结缔组织反复发作可出现纤维化，导致尿道、输卵管、输精管狭窄，恶性发展为盆腔炎、腹膜炎、宫外孕、不育症等。当粘膜上皮的淋球菌侵入血液时，还可引起播散性感染(DGI)，导致淋菌性关节炎、皮肤损害、心内膜炎、心包炎及脑膜炎，严重时可发展为淋菌性败血症。淋球菌感染后，如确诊迅速，越早治疗效果就越好。目前淋病的诊断方法已有多种，如传统的显微镜(涂片)检查和培养法，前者虽快速简便，但特异性和敏感性差，后者确诊性高，但取样困难，且诊断周期长，一般需要48-72小时方能确诊；近年来发展起来的玻片协同凝集法、荧光抗体染色法、乳胶凝集法操作简便，但阳性率低，PCR法敏感度高，但假阳性多，且操作繁琐，需要特定仪器设备。七十年代初，酶联免疫吸附试验(ENZYME LINKEDIMMUNOSORBENT ASSAY，ELISA)方法建立以来，应用于临床诊断学方面取得了飞速进展，酶联法淋病快速检测法(即ELISA)由于其以血清为标本，可用于检测抗原也可用于检测抗体，且具有采样方使，易于操作，全程检测仅需三十余分钟，是一种具有临床诊断价值的免疫学诊断新方法，尤其适用于医院、海关、防疫、计划生育、性防系统和中心血站等大批量、高危人群体检筛选检测。酶联快速检测药盒生产的首要问题是要解决淋球菌膜蛋白特异性抗原的大量生产及其分离纯化的工艺问题。该法的诊断药盒，美国ABBOTT公司已有G0NOZYME KIT商品出售，但价格昂贵，并需要配套购置专用的酶标检测仪，且未见淋球菌膜蛋白特异性抗原的大量生产及其分离纯化工艺的批露。本专利技术的目的在于要提供一种生产成本较低，能大量生产的淋病双球菌快速诊断盒及其生产工艺。本专利技术是这样实现的1，淋病快速诊断药盒，包括酶标抗体稀释液，稀释原液，底物液，显色液和终止液，抗原包被板条以及阴、阳性对照标准品，其中一，酶标抗体稀释液1000ml中含柳硫汞钠盐 50-200mg新鲜小牛血清50-300ml灭菌0.01M，pH7.4PBS 700-950ml酶标抗体(SPA-HRP) 1-2mg(1∶200，1∶2000)每瓶分装2.0-2.5ml二，稀释原液1000ml中含柳硫汞钠盐 50-250mg新鲜小牛血清50-300ml灭菌0.01-0.03M，pH7.0-7.8PBS700-950ml每瓶分装2.0-2.5ml；三，底物液1000ml0.2M磷酸氢二钠 500ml0.1M柠檬酸 500ml新鲜30％H2O2300-800μlPM抑菌剂50-75mg每瓶分装2.0-2.5ml；四，显色液1000ml中含四甲基联苯胺(TMB) 200-1500mg甲酵750ml以上摇匀，溶解后加入纯甘油 250ml每瓶分装2.0-2.5ml；五，终止液1000ml98％浓硫酸 100ml蒸馏水 900ml每瓶分装2.0-2.5ml；六，特异性淋球菌膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl)；七，阴、阳性对照标准品(一)阴性标准1000ml中含柳硫汞钠盐 50-200ml新鲜小牛血清 50-300ml灭菌0.01M，pH7.4PBS 680-930ml正常人血清 20ml每瓶分装0.5-2.1.0ml；(二)阳性标准1000ml中含柳硫汞钠盐 50-200ml新鲜小牛血清 50-300ml灭菌0.01M，pH7.4PBS680-930ml兔抗淋球菌阳性血清 10-20ml每瓶分装0.5-1.0ml；2，本专利技术的生产工艺包括(1)淋病双球菌抗原的筛选、分离和纯化；(2)免抗淋球菌抗体制备和提纯；(3)高效SPA制备及标记辣根过氧化物酶；(4)药盒检测反应条件的建立等。其中一，淋球菌的繁殖与保存(一)，专用培养基的配制配方每1000ml蒸馏水中含(1)蛋白胨 10-18g(2)酵母浸出粉 5-15g(3)葡萄糖 1-2g(4)氯化钠 1-2g(5)磷酸氢二钾 4g(6)磷酸二氢钾 1g(7)琼脂 12g(8)脱纤维羊血50-100ml制法将(1)-(7)加入上述蒸馏水混匀，在15磅高压下灭菌15分钟，待冷却至54-56℃，加入(8)，摇匀，分装至培养皿待用。(二)，将淋病菌划线接种于上述培养基中，置CO2环境37℃培养24-48小时。以5％甲醛生理水浸润培养皿30分钟，用滴管洗脱，收集至0.02M PBS，pH7.4，3000转离心15分钟，重复三次，收集沉淀，保存于质膜匀浆液内，-27℃低温储藏；(三)淋球菌的菌种保存制备淋球菌浓悬液于灭菌脱脂牛奶中，用干冰速冻，迅速移入冷冻干燥机内，迅速抽真空达到升华，保持真空状态4-5小时，到菌液完全抽干，取出，用煤气灯封口，并抽气保证内部干燥，于4℃冰箱保存；二，特异性膜蛋白抗原的纯化(1)，大量收集淋球菌培养菌液，37℃纯培养18-36小时，涂片染色，显微镜检查，证明属革兰氏阴性双球菌；氧化酶阳性，触酶阳性；生化鉴定仅发酵葡萄糖，不发酵麦芽糖、蔗糖和果糖；(2)，在上述培养菌液中加入5％甲醛生理盐水浸泡30分钟左右，用吸管洗涤，将培养皿表面菌落洗脱并收集入离心管；(3)，将(2)所得菌落洗脱液置冷冻离心机，4-10℃，3000转/分离心15分钟，弃上清液，沉淀以PBS洗涤，重复离心洗涤三次，沉淀液保存于匀浆器内待用，储藏于-27℃冰箱；(4)，上述菌液自冰箱内取出，置室温融化，冻融反复三次；(5)，将(4)所述菌液用匀浆器反复匀浆10-15分钟，再用超声波粉碎，65μA粉碎5-10分钟，至镜检无完整细胞壁；(6)，冷冻高速离心，4℃，10,000转/分，离心30分钟，取上清液，弃去沉淀；(7)，冰冻超高速离心，4℃，100,000转/分，离心60-120分钟，取沉淀，弃去上清液；(8)，沉淀用两相法精制，再用两性离子洗涤剂洗脱杂质，4℃搅拌过夜；(9)，冰冻高速离心，4℃，10,000-15,000转/分，转30-60分钟，取上清液，弃去未溶解沉淀；(10)，上清液以0.5μ滤膜过滤，滤液用紫外分光法检测蛋白质浓度；(11)，上Sephadex G-200柱层析，以PBS为洗脱液，280nm检测，收集峰值，即得电泳纯的特异性淋球菌膜蛋白抗原，测浓度，冰水浴保存；(12)，以该膜蛋白包被固相酶板或浓缩后免疫家兔，制备抗体；三，免抗淋球菌抗体的制备与纯化(一)，免疫血清的制备(1)，药品纯化抗原灭活卡介苗佐剂(2)，免疫动物健康新西兰白兔，雄性，年令六个月以上，体重2千克左右，2-3只。(3)免疫方法a，制备抗原浓度为5mg/ml，与1ml完全佐剂混合(使用注射器法)，制成油包水乳剂，乳剂的粘稠度为保证佐剂抗原滴于冷水表面保持完整而不分散；b，第一次免疫抗原总量5mg，注射体积2ml，注射部位为四足下数点，每点0.2ml，脊背皮下数点，每点0.2ml；c，第二次免疫为第一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种淋病快速诊断药盒，包括：酶标抗体稀释液，稀释原液，底物液，显色液和终止液，抗原包被板条以及阴、阳性对照标准品，其特征在于：一，酶标抗体稀释液：１０００ｍｌ中含：柳硫汞钠盐 ５０－２００ｍｇ新鲜小牛血清 ５０－３００ｍｌ灭 菌０．０１Ｍ，ｐＨ７．４ＰＢＳ ７００－９５０ｍｌ酶标抗体（ＳＰＡ－ＨＲＰ）１－２ｍｇ（１∶２００，１∶２０００）二，稀释原液：１０００ｍｌ中含：柳硫汞钠盐 ５０－２５０ｍｇ新鲜小牛血清 ５０－３００ｍｌ灭菌０．０１ －０．０３Ｍ，ｐＨ７．０－７．８ＰＢＳ ７００－９５０ｍｌ三，底物液：１０００ｍｌ０．２Ｍ磷酸氢二钠 ５００ｍｌ０．１Ｍ柠檬酸 ５００ｍｌ新鲜３０％Ｈ↓［２］Ｏ↓［２］ ３００－８００μ １ＰＭ抑菌剂 ５０－７５ｍｇ 四，显色液：１０００ｍｌ中含：四甲基联苯胺（ＴＭＢ） ２００－１５００ｍｇ甲醇 ７５０ｍｌ以上摇匀，溶解后加入纯甘油 ２５０ｍｌ五，终止液：１０００ｍｌ９８％浓硫酸 １００ｍｌ蒸馏水 ９００ｍｌ六，特异性 淋球菌膜蛋白抗原包被板（每孔加入１０μ ｇ／ｍｌ抗原包被液１００μ １）；七，阴、阳性对照标准品（一）阴性标准品 １０００ｍｌ中含：柳硫汞钠盐 ５０－２００ｍｇ新鲜小牛血清 ５０－３００ｍｌ灭菌０．０１Ｍ，ｐＨ７．４ＰＢ Ｓ ６８０－９３０ｍｌ正常人血清 １０－２０ｍｌ（二）阳性标准品 １０００ｍｌ中含：柳硫汞钠盐 ５０－２００ｍｇ新鲜小牛血清 ５０－３００ｍｌ灭菌０．０１Ｍ，ｐＨ７．４ＰＢＳ６８０－９３０ｍｌ兔抗淋球阳性血清 １ ０－２０ｍｌ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建新，
申请(专利权)人：中国科学院上海植物生理研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]