一种高产D-核糖的微生物菌株制造技术

一种能够高产Ｄ－核糖的属于枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）和短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）的微生物菌株。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高产D-核糖的微生物菌株，更具体地说，本专利技术涉及能够高产D-核糖的枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。
技术介绍
D-核糖是生物体内遗传物质-核酸的重要组成成分，又是生物体内能量代谢的重要参与者，在核苷类物质、蛋白质、脂肪代谢中处于枢纽位置，具有重要的生理功能。在工业上，D-核糖既是维生素B2的合成原料，又可用于抗病毒、抗肿瘤药物的合成，在治疗心肌局部缺血和防治因运动而引起的肌肉僵硬、肌肉酸痛方面也具有良好的作用。近年来，随着D-核糖在医疗保健领域的广泛应用，其越来越引起人们的重视，各国科学家都争先恐后地致力于建立适合规模化大生产的D-核糖的制备方法。D-核糖的制备方法包括从天然物质中提取分离、化学合成和微生物发酵等方法。从天然物中提取分离D-核糖，提取过程繁杂、制造成本高，不适合规模化生产。就合成法而言，人们先后尝试了从D-阿拉伯糖(Gehrke and Aichner，1927)、D-葡萄糖酸(Steiger，1936)、D-葡萄糖(Korczynski A et al.1979)、L-谷氨酸和D-木糖(Lacourt Gadras，et al.1992)合成D-核糖，20世纪八十年代以前，国内外主要采用由葡萄糖化学合成法进行D-核糖的工业化生产，即由葡萄糖经氧化、置换、转化、再置换、酸化、内酯化、还原等七步反应制得D-核糖，该法不仅步骤复杂、所用设备多、收率低、制造成本高，而且其所涉及的贡电极还原反应还会造成严重的环境污染。进入20世纪九十年代后，人们开始使用微生物发酵法生产D-核糖，发酵法在常温常压下进行，原材料来源广泛，又避免了化学合成法的环境污染，被称为生产D-核糖的最佳方法。发酵法生产中广泛采用的是芽孢杆菌属的微生物。K.Sasajima等(K.Sasajima and M.Yoneda，Agr.Biol.Chem.，35(4)，509-517)发现，芽孢杆菌属的转酮醇酶缺陷型菌株具有产生D-核糖的能力，他们获得了在培养基中积累D-核糖35mg/ml的变异菌株，并经过菌种的数次改良，获得了最高产糖72.3mg/ml的高产菌株(美国专利3,970,522，1976)，但他们优选的发酵培养基中，以干酵母为主要氮源，并加入三种芳香族氨基酸，是一种不十分经济的配方选择。日本公开特许公报平1-157396(1989)和美国专利4,904,587(1990)公开了一种采用芽孢杆菌突变株发酵生产D-核糖的方法，其发酵培养基中要使用由特定方法制备的、各种氨基酸含量在一定范围内的玉米浆。尽管其发酵培养基中积累的D-核糖最高可达95.2mg/ml，但由于芳香族氨基酸的量控制着所使用的菌株的发酵，需要控制培养基中芳香族氨基酸的含量，才能使突变株积累大量的D-核糖，因此，这种方法工艺复杂、成本高。因此，目前还没有一种适宜于工业化发酵生产的、营养要求粗放、原材料来源广泛、发酵过程易于控制的高产D-核糖的理想菌株。
技术实现思路
要解决的问题本专利技术的目的是提供一种能够在以玉米浆为主要氮源的发酵培养基上大量积累D-核糖、营养要求粗放、原材料来源广泛、发酵过程易于控制的具有工业化应用潜力的D-核糖高产菌株。技术方案本专利技术专利技术人以芽孢杆菌属的菌种为出发菌株，采用诱变剂处理菌体细胞，获得了转酮醇酶缺陷型突变株，对这些突变菌株进行进一步的诱变，终于获得了能够以玉米浆为主要氮源、营养要求粗放、原材料来源广泛、适合大规模生产的D-核糖高产新菌株。作为出发菌株，本专利技术专利技术人采用了芽孢杆菌属的野生型菌株，如短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对出发菌株的处理中，诱变剂采用了紫外线或亚硝基胍等物理、化学诱变剂。对短小芽孢杆菌P和枯草芽孢杆菌S，按常规诱变法，用紫外线、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯等物理化学诱变剂，连续或相间对菌体细胞进行诱变，诱变后，涂布培养于完全培养基平板上，32～35℃下培养36～48小时，待菌落长好后，用无菌牙签分别点种于基本培养基和补充了莽草酸的补充培养基平板上，32～35℃下培养36～48小时，挑选在补充培养基上生长良好，而在基本培养基上不能生长的菌株，从而获得了15株需要莽草酸的变异菌株。用于诱变后突变株鉴定的培养基为基本培养基(％)葡萄糖0.5，硫酸铵0.4，磷酸氢二钾1.4，磷酸二氢钾0.6。硫酸镁0.02，硫酸锰0.001，生物素0.0004，琼脂2.0。补充培养基在基本培养基中添加5μg/ml的莽草酸。为了分析变异菌株的代谢产物，选用种子培养基(％)葡萄糖2.0，玉米浆1.5，酵母膏0.5，磷酸氢二钾0.3，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.05，硫酸锰0.005(pH7.0)；发酵培养基(％)葡萄糖15，玉米浆2.0，酵母膏0.5，硫酸铵0.5，硫酸锰0.005，碳酸钙2.0(pH7.0)进行摇瓶发酵试验。在往复式摇床(频率95次/分、冲程8.5cm)上，种子培养基和发酵培养基装量均为50ml/500ml三角瓶，接种量为10％，培养温度32～38℃的条件下，通过摇瓶发酵试验，对所获得的变异菌株及其亲株的发酵代谢产物通过层析法进行了测定，结果表明这些变异株中，只有P8、S6、S19三株在其发酵液中积累的产物与D-核糖标准品的Rf值一致，而它们的亲株及其它12株变异株均不积累D-核糖。为进一步了解能够积累D-核糖的变异株的遗传特征，我们采用Sasajima等(Agr.Biol.Chem.，38(7)，1297～1303，1974)的方法，对P8、S6、S19及其亲株，按如下程序测定了其转酮醇酶活性。(1)细胞抽提液(A)的制备程序将需要测定转酮醇酶活性菌株的斜面培养物，接种于由山梨醇2.0％，L-谷氨酸钠0.1％，(NH4)2SO40.5％，MgSO4·7H2O 0.1％，KH2PO40.1％，K2HPO4·3H2O 0.3％，FeSO4·7H2O 0.00l％，ZnSO4·7H2O0.001％，MnSO4·4-6H2O 0.001％，生物素4μg/ml，盐酸硫胺素3μg/ml，莽草酸100μg/ml(pH7.0)组成的培养基中。35℃培养24小时，离心收集菌体(4000r/min，30min)，用含有0.01M巯基乙醇的0.01M tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗菌体二次。并使菌体悬浮在该缓冲液中，使菌体悬液在650nm处的吸光度为10。按50r/mL的量加入蛋白溶菌酶，37℃保温60分钟，离心(13000r/min，20min)，取上清液作为细胞抽提液(A)，用作被测酶溶液。(2)分析转酮醇酶活性的溶液反应液A(1.11ml)20μmol的D-核糖5-磷酸，0.5μmol的NADH，足够的D-核糖5-磷酸-异构酶和D-核酮糖5-磷酸3-差向酶，0.66单位的含有足够丙糖磷酸异构酶的a-甘油磷酸脱氢酶，0.43μmol的硫胺素焦磷酸和40μmol的tris-HCl缓冲液(pH7.5)。反应液B(0.89ml)20μmol的MgCl2，0.43μmol的硫胺素焦磷酸和40μmol的tris-HCl缓冲液(pH7.5)和10μl的酶溶液。(3)转酮醇酶活性分析的程序每种反应液30℃预热10分钟，然后混合反应液(总体积2.0ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高润香，李文濂，宋如生，彭春燕，
申请(专利权)人：诚志生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：