在低等真核生物中产生半乳糖基化糖蛋白制造技术

本发明专利技术提供了产生人样糖蛋白的新型低等真核生物宿主细胞，所述糖蛋白的特征在于含有末端β－半乳糖残基并基本上缺少岩藻糖和唾液酸残基。本发明专利技术还提供了催化从ＵＤＰ－半乳糖将半乳糖残基转移至重组低等真核生物宿主细胞的受体底物上的方法，所述底物可被用作治疗性糖蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利说明在低等真核生物中产生半乳糖基化糖蛋白 相关申请的交叉参考本申请是美国申请号10/371,877(2003年2月20日提交)的部分接续申请，美国申请号10/371,877是美国申请号09/892,591(2001年6月27日提交)的部分接续申请，美国申请号09/892,591根据35U.S.C.§119(e)要求美国临时申请号60/214,358(2000年6月28日提交)、美国临时申请号60/215,638(2000年6月30日提交)和美国临时申请号60/279,997(2001年3月30日提交)的利益，上述各申请被全文引入此处以供参考。本申请还是PCT/US02/41510(2002年12月24日提交)的部分接续申请，PCT/US02/41510要求美国临时申请号60/344,169(2001年12月27日提交)的利益，上述各申请被全文引入此处以供参考。本申请还要求美国临时申请号60/562,424(2004年4月15日提交)的优先权，所述申请被全文引入此处以供参考。专利
本专利技术涉及在低等真核生物中的蛋白质糖基化工程领域，特别地涉及产生含有末端半乳糖残基的糖蛋白。本专利技术进一步涉及新型宿主细胞，所述细胞包含酶编码基因，所述酶参与聚糖的半乳糖基转移以及尤其可用作治疗剂的糖蛋白的产生。专利技术背景酵母和丝状真菌均已被成功地用于生产重组蛋白质，包括细胞内和分泌型的(Cereghino，J.L.和J.M.Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24(1)45-66；Harkki，A.等，1989 Bio-Technology 7(6)596；Berka，R.M.等，1992 Abstr.Papers Amer.Chem.Soc.203121-BIOT；Svetina，M.等，2000 J.Biotechnol.76(2-3)245-251)。多种酵母，诸如乳克鲁维氏酵母(K.Lactis)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤氏酵母(Pichia methanolica)和多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)作为真核生物表达系统已经有特别重要的作用，因为它们能够生长至高细胞密度并分泌大量的重组蛋白。同样，丝状真菌，诸如黑色曲霉(Aspergillus niger)、镰孢属物种(Fusarium sp)、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)以及其它真菌已被用于以工业规模高效生产糖蛋白。但是，在任何这些真核生物微生物中表达的糖蛋白与动物中的糖蛋白在N-聚糖结构上存在相当大差异。这已妨碍了酵母或丝状真菌作为宿主在制备糖基化治疗性蛋白质中的应用。目前，表达系统诸如酵母、丝状真菌、植物、藻类和昆虫细胞系(低等真核生物)正被研究用于生产治疗性蛋白质，这些系统与哺乳动物系统相比，更为安全、快速而且生产出的产物效价更高。这些系统共同具有N-连接的寡糖合成的共有分泌途径。近来，已表明巴斯德毕赤氏酵母的分泌途径可再进行基因工程改造以实现顺序糖基化反应，该反应模拟人类和其它高等哺乳动物中N-聚糖的早期加工(Choi等，Proc Natl Acad Sci USA.2003 Apr 29；100(9)5022-7。此外，已显示了在巴斯德毕赤氏酵母中通过重新工程改造分泌途径以生产具有缺少半乳糖的复合N-聚糖的人类糖蛋白(Hamilton等，Science.2003 Aug29；301(5637)1244-6)。在哺乳动物细胞中，进一步的成熟包括半乳糖转移。因此，来自酵母和低等真核生物的复合糖基化途径的成熟需要β1，4-半乳糖基转移酶的功能性表达。在哺乳动物细胞、昆虫细胞(例如，Sf-9)和酵母细胞中已经证实了UDP-GalβGlcNAcβ1，4-半乳糖基转移酶(β1，4GalT)的重组表达。在甲基营养酵母巴斯德毕赤氏酵母中也已经表达了编码可溶形式的人类β1，4-半乳糖基转移酶I(EC 2.4.1.22)(缺少内源II型膜结构域)的cDNA。Malissard等，Biochem BiophysRes Commun.2000 Jan 7；267(1)169-73。此外，编码与人β1，4-半乳糖基转移酶(Gal-Tf)催化结构域相融合的ScMnt1p的基因融合体已被表达，从而在酵母高尔基体中显示出一些酶活性，尽管处于非常低的转化效率。Schwientek等，J BiolChem.1996 Feb 16；271(7)3398-405。因此，将β1，4-半乳糖基转移酶(β1，4GalT)靶向产生包含末端GlcNAc的聚糖的宿主分泌途径，预期将导致一些半乳糖的转移。但是，在高等真核生物中复合聚糖的形成要涉及甘露糖苷酶II作用，该酶在哺乳动物细胞中已知与GalTI竞争作用(Fukuta等，Arch Biochem Biophys.2001 Aug 1；392(1)79-86)。由此预期GalT的过早作用将阻止分泌途径中复合半乳糖基化糖蛋白的形成以及主要生产出杂合聚糖。哺乳动物糖蛋白的N-聚糖一般包括半乳糖、岩藻糖和末端唾液酸。这些糖通常不会见于在酵母和丝状真菌中产生的糖蛋白。在人类中，核苷酸糖前体(例如UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-N-乙酰神经氨酸、UDP-半乳糖、GDP-岩藻糖等)在胞质中合成并被转运至高尔基体，在高尔基体它们由糖基转移酶掺入N-聚糖(Sommers和Hirschberg，1981 J.Cell Biol.91(2)A406-A406；Sommers和Hirschberg 1982 J.Biol.Chem.257(18)811-817；Perez和Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138709-715)。在异种蛋白表达系统中的糖基化工程改造包括核苷酸糖前体合成中所涉及的各种酶的表达。酶UDP-半乳糖4-差向异构酶通过C4的差向异构化将糖核苷酸UDP-葡萄糖转变为UDP-半乳糖。该酶还可见于能将半乳糖用作为唯一碳源的生物中。近来，双功能性酶Gal10p已经在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中得到纯化，其有UDP-半乳糖4-差向异构酶和醛糖1-差向异构酶两种活性。Majumdar等，Eur J Biochem.2004 Feb；271(4)753-759。UDP-半乳糖转运蛋白(UGT)可将UDP-半乳糖从胞质转运至高尔基体腔。两种异源基因，即源自粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的编码α1，2-半乳糖基转移酶(α1，2GalT)的gmal2(+)和编码人UDP-半乳糖转运蛋白的(hUGT2)，已经在啤酒糖酵母中功能性表达，以检查半乳糖基化所需的细胞内条件。蛋白半乳糖基化作用与UDP-半乳糖转运活性之间的关联，表明UDP-Gal转运蛋白的外源供应在啤酒糖酵母有效半乳糖基化中发挥关键作用(Kainuma，1999 Glycobiology 9(2)133-141)。同样地，来自粟酒裂殖糖酵母的UDP-半乳糖转运蛋白也已被克隆(Aoki，1999 J.Biochem.126(5)940-950；Sega本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生人样糖蛋白的重组低等真核生物宿主细胞，所述糖蛋白的特征在于含有末端β－半乳糖残基并基本上在糖蛋白上缺少岩藻糖和唾液酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R戴维森，T格恩格洛斯，S维尔德特，BK蔡，J内特，P博布罗维茨，S哈米尔顿，
申请(专利权)人：格利科菲公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]