具有经修饰的岩藻糖基化的糖蛋白的生产制造技术

公开了使缺乏岩藻糖基化糖蛋白Ｎ－聚糖的内源性途径的基因工程宿主细胞能够生产具有岩藻糖基化Ｎ－聚糖的糖蛋白方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有经修^饰的岩藻糖基化的糖蛋白的生产
技术介绍
(1 )专利
本专利技术涉及糖生物学领域，并且具体而言涉及使缺乏岩藻糖基化糖蛋白7V-聚糖的内源途径的基因工程宿主细胞能够生产具有岩藻糖 基化,聚糖的糖蛋白的方法。 (2)相关技术描述用于人体的糖基化治疗性蛋白质应具有复杂型、人,糖基化类 型。 一般而言，使用细菌或真核微生物生产治疗性蛋白质是有利的， 因为(a)可快速生产高浓度的蛋白质；(b)可使用无菌的控制良好 的生产条件(例如GMP条件)；(c)可使用简单的化学成分确定的生 长培养基；(d)易于基因操作；(e)不存在污染性的人或动物病原体； (f)可表达多种蛋白质，包括由于毒性等原因在细胞培养中表达低 的那些，以及(g)易于蛋白质回收(例如通过分泌进入培养基中)。 但是，原核生物和低等真核生物通常不产生具有复杂型7V-糖基化类 型的蛋白质。因此，通常使用动物细胞生产治疗性蛋白质，其中需要 该蛋白质具有复杂型、类似于人AM唐基化类型。但是，使用动物细 胞生产治疗性蛋白质具有许多显著的缺点。只有某些治疗性蛋白适于在动物细胞(例如，缺乏任何细月包毒性 作用或对生长不利的其他作用的那些)中表达。动物细胞培养体系通 常非常緩慢，时常需要在仔细控制的条件下生长多于一个星期以生产 任何可用量的所关注蛋白质。虽然如此蛋白质产量仍比不过微生物发 酵法。此外，细胞培养体系通常需要复杂和昂贵的营养和辅因子，例 如胎牛血清。而且，程序性细胞死亡(凋亡)可限制生长。而且，动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)极易被病毒感染或污染。在一些情况下，病毒或其他传染物可危害培养物的生长，而在其他情 况下该传染物可为人病原体，使得治疗性蛋白质产品不适于其预期用 途。此外，许多细胞培养过程需要使用复杂的、温度敏感的、衍生自动物的生长培养基组分，其可能携带病原体例如牛海绵样脑病(BSE)朊病毒。该类病原体难以纟企测和/或难以去除或杀灭而同时不破坏生 长培养基。在任何情况下，使用动物细胞生产治疗性蛋白质必需进行 费用高昂的质量控制以确保产品的安全性。最近，已显示低等真核生物尤其是酵母可经基因修饰从而表达具 有类似于人或人源化的复杂型w-糖基化类型的蛋白质。可通过去除参与生产高甘露糖,聚糖的所选内源糖基化酶并引入参与生产复杂 型,聚糖的外源酶的多种组合获得该类经基因修饰的低等真核生物。 基因工程酵母生产复杂型,聚糖的方法已描述于美国专利号 7029872和美国已公布专利申请号2004/0018590、 2005/0170452、 2006/0286637 、 2004/0230042 、 2005/0208617 、 2004/0171826 、 2005/0208617和2006/0160179。举例而言，可筛选或工程化宿主细胞 以去除1,6-甘露糖基转移酶活性，否则其会将甘露糖残基添加至糖蛋 白的7V-聚糖；接着进一步工程化以包括参与生产复杂型、类似于人 7V-聚糖的各种酶。动物和人类细胞具有岩藻糖基转移酶途径，其可将岩藻糖残基添 加至蛋白质N-聚糖还原末端的GlcNAc残基。人类的岩藻糖基化途径 由以下组成GDP-甘露糖脱水酶和GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶 /GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶(FX蛋白)，二者均位于细胞质， 一起 将GDP-甘露糖转化至GDP-岩藻糖；位于高尔基体膜上的GDP-岩藻 糖转运体，其可将GDP-岩藻糖运输至高尔基体；以及岩藻糖基转移 酶(Fut8)，其可通过l,6-键的方式将岩藻糖残基转移至AA-聚糖还原 末端GlcNAc残基的6位。与高等真核生物相反，许多低等真核生物 例如酵母缺乏参与岩藻糖基转移酶途径的酶，产生不包含岩藻糖的糖 蛋白(参见，例嗦口， Bretthauer/Catellino， Biotechnol. Appl. Biochem. 30:6193-200 (1999); Rabina等，Anal. Biochem. 286: 173-178 (2000))。然而， 糖蛋白上缺乏岩藻糖已显示在某些情况下具有优势。举例而言，在单 克隆抗体、免疫球蛋白分子和相关分子的生产中，已显示从免疫球蛋 白的N-聚糖去除岩藻糖可增加或改变其与所选Ig受体的结合，这会 引起抗体-依赖性细胞毒性即ADCC等性质的改变(参见，例如，美 国已公布专利申请号2005/0276805和US2003/0157108 )。然而，虽然从免疫球蛋白的N-聚糖去除岩藻糖似乎可增强免疫 球蛋白的ADCC活性，但是岩藻糖基化N-聚糖看来对其他糖蛋白而 言是重要的。例如，小鼠中岩藻糖基转移酶基因的缺失可诱导严重的 生长迟緩、出生后发育中的早期死亡以及肺部的气肿样改变。可通过 给予外源TGF-pi挽救这些尸M,^-缺陷型小鼠的气肿样表型。此外， 通过重新引入Fut8基因可挽救受损的受体-介导的信号转导，表明核 心岩藻糖基化对于生长因子受体例如TGF-(31和EGF的正常功能是必 需的(Wang等，Meth. Enzymol. 417: 11-22 (2006)。在获自Fw^J、鼠 的肺组织中，核心岩藻糖基化的丟失损害低密度脂蛋白(LDL)受体-相关蛋白质-l(LRP-l)的功能，引起胰岛素样生长因子(IGF)-结合蛋 白-3 (IGFBP-3)的胞吞作用降低(Lee等，J. Biochem. (Tokyo) 139: 391-8 (2006)。在F^^-小鼠的胚成纤维细胞中，a3(31整合素-介导的 细胞迁移停止并且细胞信号转导降低，从而鉴定核心岩藻糖对蛋白质 功能是必需的(Zhao等，J. Biol. Chem.， 281: 38343-38350 (2006)。此外， 有的情况下需要生产抗体组合物，其中组合物中的至少一部分抗体被 岩藻糖基化以P务低ADCC活性。因此，在具体情况下提供可生产岩 藻糖基化糖肽的低等真核生物和细胞是有利的。因此，用于制备低等 真核宿主细胞(例如真菌和酵母，尤其是酵母例如巴斯德毕赤酵母、 乳酸克鲁维斯酵母和其他)的方法和材料的发展将有助于用于重组生 产岩藻糖基化糖蛋白的基因强化酵母林的发展。 专利技术概述因此，本专利技术提供制备可用于生产重组、岩藻糖基化糖蛋白的低等真核表达系统的方法和材料。具体而言，提供载体(包含编码一个 或多个参与哺乳动物岩藻糖基化途径的酶的基因)和已用这些载体转 化以制备可生产岩藻糖基化糖蛋白的宿主细胞的低等真核宿主细胞。 这些载体、宿主细胞和方法尤其适用于基于酵母和真菌宿主细胞例如 巴斯德毕赤酵母的表达系统。在一个实施方案中，本专利技术提供用一个或多个编码将GDP-甘露 糖转化至GDP-岩藻糖并将岩藻糖与宿主细胞生产的7V-聚糖结合的酶 活性的载体转化低等真核宿主细胞的方法和材料。在另一实施方案 中，本专利技术包括编码融合蛋白的杂交载体，该融合蛋白包含与非天然 前导序列融合的岩藻糖基化途径酶的催化结构域，所述前导序列编码 将融合肽靶向内质网、早期高尔基体或晚期高尔基体的适当位点的靶 向序列。举例而言，岩藻糖基转移酶的催化结构域与将该催化结构域 靶向内质网、早期高尔基体或晚期高尔基体中的位点的前导肽融合。 在另 一实施方案中，用编码GDP-岩藻糖转移酶(将GDP-岩藻糖从细 胞质转移至高尔基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组低等真核生物宿主细胞，其包含岩藻糖基化途径。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-3-7 60/905,3451.一种重组低等真核生物宿主细胞，其包含岩藻糖基化途径。2. 权利要求1的宿主细胞，其为酵母或丝状真菌。3. 权利要求2的宿主细胞，其中所述酵母为毕赤酵母属酵母。4. 权利要求3的宿主细胞，其中所述毕赤酵母属酵母为巴斯德 毕赤酵母。5. 权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞就糖蛋白上的7V-聚糖而言进一步不显示al,6-甘露糖基转移酶活性并且包括与细胞輩巴 向信号肽融合的al,2-甘露糖普酶催化结构域，该信号肽通常与该催 化结构域无关并选用来将al,2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER 或高尔基体，藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产 生了包含岩藻糖基化Man5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。6. 权利要求5的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融 合的GlcNAc转移酶I催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无 关并选用来将GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体； 藉此当重組糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻 糖基化GlcNAcMan5GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。7. 权利要求6的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融 合的甘露糖苷酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并 选用来将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体；藉此当 重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖基化 GlcNAcMan3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。8. 权利要求7的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融 合的GlcNAc转移酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无 关并选用来将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体； 藉此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻 糖基化GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。9. 权利要求8的宿主细胞，其进一步包括与细胞靶向信号肽融 合的半乳糖转移酶II催化结构域，该信号肽通常与该催化结构域无关并选用来将半乳糖转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体；藉 此当重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体时产生了包含岩藻糖 基化Gal2GcNAc2Man3GlcNAc2糖形的重组糖蛋白。10. 权利要求9的宿主细胞，其进一步包...

【专利技术属性】
技术研发人员：S哈米尔顿，
申请(专利权)人：格利科菲公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]