一种重组人肝细胞生长因子rhHGF蛋白质的表达方法技术

本发明专利技术公开了一种用真核表达体系制备肝细胞生长因子（ｒｈＨＧＦ）蛋白质的方法，通过克隆ｈＨＧＦ基因，构建真核表达质粒ｐＲＣ／ＣＭＶ－ｒｈＨＧＦ，选用细胞株稳定、表达效率高的ＣＨＯ和易成活、生活周期短、生长速度快的ＮＲＫ作为宿主细胞表达出具有野生活性的ｒｈＨＧＦ，与传统的原核表达体系相比，具有易于合成、ｒｈＨＧＦ可有效分泌到培养液中、加工方式与天然蛋白相似、能发生折叠、形成二硫键、能发生糖基化、多聚化及前体加工和修饰等优点，不但成活工艺简单，而且保证了表达产物功能活性的存在，提供了一种用外源基因表达产生基因工程药物的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质的表达方法，该方法是通过真核基因工程方法来表达具有野生活性的rhHGF蛋白质。1.rhHGF表达载体pLX008的构建2.rhHGF在真核细胞中的表达3.表达产物活性测定二、步骤1..rhHGF表达载体pLX008的构建用BamHI和XbaI完全酶切含有HGFcDNA全序列基因片段的重组质粒PBSKS-HGF(由美国著名科学家闫占清馈赠)，获得了长2.2kb的HGF cDNA完整序列，插入经BamHI和XbaI双酶切的带有强启动效应的巨细胞病毒启动子的载体pRC/CMV(由美国著名科学家闫占清馈赠)，获得重组质粒pLX008。经筛选及限制性内切酶谱鉴定重组正确后，纯化质粒。2.人HGF在真核细胞中的表达将纯化的表达载体pLX008用磷酸钙-DNA共沉淀法转染大鼠肾成纤维细胞(NRK购自中国科学院上海细胞所)及中国仓鼠卵细胞(CHO购自中国科学院上海细胞所)，采用G418(美国GIBCO产品)抗性筛选法，筛选两种细胞有阳性克隆出现后，将细胞克隆扩大培养。之后常规传代，待生长到60-80％融合时，更换不含G418的培养基，融合状态后继续培养24-48小时。收集培养物于无菌离心管中，900-1200r/min离心20分钟，取培养物上清分装后-20℃保存，用作条件培养基。3.结果及表达产物活性测定用HCC-7902细胞(肝癌细胞)及原代培养成年大鼠肝细胞对培养基上清进行活性测定。3H-TdR掺入分析证明，它能有效地抑制体外培养的人肝癌细胞的生长，并可以明显刺激鼠肝细胞DNA的合成。结果表明rhHGF基因在宿主细胞中得到正确的转录和翻译，并将有生物活性的表达产物分泌到培养基中。本专利技术的关键之一在于选用带有强启动效应的巨细胞病毒启动子的pRC/CMV作为载体，并选用限制性内切酶BamHI和XbaI将rhHGFcDNA序列定向重组于真核细胞表达性载体pRC/CMV中，获得了真核表达质粒pRC/CMV-rhHGF；关键之二在于本专利技术分别选用了细胞株稳定、表达效率高的CHO和易成活、生活周期短、生长速度快的NRK作为宿主细胞；关键之三在于用G418筛选转染阳性细胞。下面所列实施例是为便于对本专利技术的理解而非任何限制性目的。实施例1.hHGF真核表达质粒的构建1.hHGF基因片段的制备用BamHI和XbaI消化PBSKS-HGF质粒，电泳证实酶切完全后，用低熔点胶回收其中的2.2kb长的DNA片段。微型胶定量，调节DNA浓度为0.1μg/μl。2.载体pRC/CMV的制备pRC/CMV质粒5μg，在50μl反应体积中，用BamHI/XbaI各1μl消化5小时，取6μl电泳观察酶切情况，用0.8％低熔点胶分离5.44kb的区带，回收纯化后调节浓度为0.3μg/μl。3.基因片段与线性化pRC/CMV的连接、转化及阳性克隆的筛选取HGF DNA片段0.6μg和线性化pRC/CMV载体0.4μg，(两者摩尔比3∶1，DNA总量1μg)，混匀，42℃水浴15分钟，冰浴冷却后加4μl 10×连接反应缓冲液，2μlT4DNA连接酶，用双蒸水补足20μl反应体积，16℃反应12小时。取7μl连接反应混合物转化JM105，将50-100μl转化菌液涂布于Amp阳琼脂板上，37℃温育过夜后，筛选阳性菌落。4.pRC/CMV-HGF的筛选与鉴定选取3-5个单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，进行质粒的小量快速抽提。获得质粒后，从每份样品中取0.5-1μg DNA，进行内切酶分析。经过酶切鉴定分析，HGF基因插入位点和方向完全正确，该质粒的结构完全符合设计要求。挑选含有正确重组质粒的转化菌株，大量扩增，经质粒抽提和纯化后，-20℃保存备用。实施例2.hHGF蛋白质在真核细胞中的表达1.细胞培养用三蒸水配制细胞培养液(含DMEM培养基；三抗100u/ml青霉素，100mg/ml链霉素，3mg/ml两性霉素；10％小牛血清)，在37℃、5％CO2浓度条件下分别培养NRK、CHO细胞，一般第72-96小时传代一次，但不同的细胞情况不完全一样。传代时，用pH7.2的PBS冲洗细胞，适量0.25％胰酶消化1-3分钟(不同细胞株对胰酶的耐受性不同)，待细胞尚未脱壁时，弃去胰酶，加少量含血清培养基，吸管吹打制成细胞悬液，根据实验需要，按不同密度分装入新的培养瓶，补足培养基，常规培养。2.培养细胞外源基因转染采用磷酸钙-DNA共沉淀法。1).转染前20小时传代细胞，以2×105/cm2密度接种于60mm直径平皿中培养，待细胞铺满平皿85-90％时进行转染，转染前4-6小时须更换培养液。2).制备磷酸钙-DNA沉淀先将10μl 0.1×TE的DNA溶液(含DNA浓度0.9μg/μl)及125μl 2×HBS(50mM Hepes、280mM NaCl、15mM Na2HPO4、10mM KCl、12mM Glucose，pH5.68)混匀后，缓慢沿壁加入18μl 2mol/L CaCl2边加边摇，室温放置10-15分钟。3).欲转染细胞吸去旧培养液，用无菌滴管加上述DNA沉淀液于细胞层上，室温孵育10分钟，再将原培养液加回平皿中，37℃、5％CO2培养6-12小时(NRK、CHO不同)，吸出沉淀液，PBS洗细胞二次，更换新鲜培养基(含10％胎牛血清)继续培养48-72小时。4).抗性转染细胞株的筛选采用G418抗性筛选法，培养48-72小时的转染细胞1∶2传代，生长至50-70％融合时，加G418至终浓度200mg/ml，以后每12小时增加一次剂量，最终达600-800mg/ml，3-4天更换一次培养基，去除死亡细胞。待大部分细胞死亡后，G418浓度可降为200mg/ml以维持筛选作用。约10-14天，可见细胞克隆或集落。同时，用未转染细胞作阴性对照。实施例3 表达产物生物活性测定方法1).表达细胞液的收集将阳性克隆扩大培养，常规传代，生长到50-70％融合时，更换不含G418的培养基，融合状态后继续培养24-48小时。收集培养基于无菌离心管中，800-1000r/min离心10分钟，取上清培养基分装后-20℃保存，用作条件培养基。2).肝癌细胞生长曲线观察HCC-7902常规培养至融合，0.25％胰酶消化3分钟，制成单细胞悬液，，以104个细胞/孔的密度接种24孔板。分别设置实验组和对照组。实验组按30％体积比加入转染阳性细胞培养液，对照组则加入同等体积的未转染细胞培养液。两组细胞分别又分成5个小组，每小组含3个平行孔。37℃、5％CO2培养，每天更换一次培养基。接种后，每隔48小时，两组细胞各检测其中一个小组，进行细胞计数。计数前每孔加150μl胰酶，准确消化3分钟后加500μl培养基终止消化，吸管反复吹打，以细胞计数板计数，每孔计数3次，每计一次数3遍，计数后的细胞弃去。结果转染细胞表达产物HGF生物活性的测定本专利技术分别用肝癌细胞HCC-7902和原代培养的成年大鼠肝细胞对HGF进行活性检测。(一)肝癌细胞生长曲线的观察HCC-7902单细胞悬液，以104/孔细胞数接种24孔板。实验组每孔加30％(V∶V)的条件培养基，对照组加未转染的细胞培养基，分别于接种后48h，96h……计数细胞。同时观察了两种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用真核表达体系制备肝细胞生长因子ｒｈＨＧＦ蛋白质的方法，其特征在于所说的方法包括以下步骤：ｈＨＧＦ基因的获取，ｒｈＨＧＦ表达载体ｐＬＸ００８的构建和ｒｈＨＧＦ在真核细胞中的表达及分离纯化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：牛勃，常冰梅，向前，解军，杨涛，闫占清，郭勇，胡晓年，杨琦，张悦红，
申请(专利权)人：四川汉龙高新技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]