含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法及其用途技术

本发明专利技术属于一种用于治疗恶性肿瘤的转基因肿瘤细胞的制备方法，特别涉及一种含有转白细胞介素－２３基因的肿瘤细胞的制备方法。主要利用载体将白细胞介素－２３导入肿瘤细胞用于治疗恶性肿瘤。本发明专利技术解决了其他肿瘤治疗方法对机体产生的副作用及不具有长期改善预后的效果，如化学药物治疗及放射治疗常可抑制骨髓造血和机体免疫功能，导致易发感染和抗肿瘤免疫应答能力低下；手术创伤也可抑制机体的各种免疫功能，还有使微小转移灶扩大的危险等缺点。具有可主要作用于免疫应答初期，活化树突状细胞以诱导自然杀伤细胞活化的特性。将白细胞介素－２３基因导入肿瘤细胞通过产生白细胞介素－２３发挥较强的抗肿瘤效果。而且白细胞介素－２３可诱导记忆性Ｔ细胞增殖与活化，分泌ＩＦＮ－γ，调节免疫功能、抑制肿瘤部位血管的生成，从而达到治疗恶性肿瘤效果。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种用于治疗恶性肿瘤的转基因肿瘤细胞的制备方法，特别涉及一种转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法。
技术介绍
目前，肿瘤的主要治疗手段包括手术切除、放射治疗和化学药物治疗，这些治疗方法对机体均有一定副作用，不具有长期改善预后的效果，如化学药物治疗及放射治疗常可抑制骨髓造血和机体免疫功能，导致易发感染和抗肿瘤免疫应答能力低下；手术创伤也可抑制机体的各种免疫功能，还有使微小转移灶扩大的危险。直接用细胞因子治疗肿瘤已取得了一定的疗效，但是，细胞因子在体内的半衰期较短，在血中很难维持一定的浓度，且投入量过大又有较强的副作用，所以，严格限制向体内直接投入重组细胞因子。同时，体外培养的免疫细胞也可用于肿瘤治疗，但往往不能达到预期结果。最近，由树突状细胞分泌的新的细胞因子白细胞介素-23(IL-23)被鉴定，白细胞介素-23由p19和p40两个亚单位分子组成，白细胞介素-23与白细胞介素-12(由p35和p40两个亚单位分子组成)共有一个p40分子，p19亚单位与p35亚单位的氨基酸序列也有较高的同源性，构造也十分相似。用白细胞介素-12、白细胞介素-2、IFN-α、IFN-γ、TFN-α等重组细胞因子治疗肿瘤，都显示出一定的疗效，但是尚处于临床试验阶段，还没有取得临床疗效的结果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供可用于治疗恶性肿瘤的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，以克服现有技术存在的不足。含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法是利用载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞。本专利技术的具体技术方案是载体选用病毒或脂质体。脂质体选用lipofectin脂质体。以病毒为载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞包括以下步骤(1)采用异硫氢酸胍一步法从小鼠脾细胞中提取组织总RNA； (2)将通过反转录聚合酶链反应法获得小鼠白细胞介素-23p19和p40cDNA，将获得的cDNA插入TA Cloning试剂盒中的Pcr2.1载体，并行聚合酶链反应后用DNA测序仪进行测序验证cDNA的正确性；将验证序列后的cDNA用限制性核酸内切酶和DNA连接酶将其插入病毒载体；(3)利用试剂盒将步骤(2)获得的病毒载体导入包装细胞，该包装细胞能将病毒载体包装成完整的病毒并将其分泌到培养上清中；(4)收集步骤(3)培养上清，假如60％-70％融合生长PA317细胞的培养皿中，加入四聚季胺(终极浓度为8μg/ml)；37℃培养5-6小时后弃去上清，加入新鲜培养基继续培养24小时，收集并调整细胞浓度为1×106个/毫升，以10倍，100倍，1000倍，10000倍稀释培养基后，加入培养皿中继续培养并加入新霉素(终极浓度为600μg/ml)进行筛选，待单个细胞长成克隆，分别以37℃、5％CO2和相同细胞浓度培养各个克隆细胞并收集培养上清，以RNA印迹法鉴定白细胞介素-23基因转染是否成功及表达量的高低，选择高表达白细胞介素-23的PA317细胞的培养上清，以相同方法感染结肠癌细胞，选择高表达白细胞介素-23的结肠癌细胞，建立结肠癌细胞/白细胞介素-23的克隆肿瘤细胞。所述的限制性核酸内切酶选用Ecol RI和Bam HI。试剂盒选用lipofectamine试剂盒。包装细胞选用Φ-2包装细胞。培养基选用含10％胎牛血清，100单位/毫升青链霉素的RPMI1640或DMEM培养基。该肿瘤细胞的用途是将其接种于荷瘤机体治疗恶性肿瘤。具体接种方法为将0.2毫升含白细胞介素-23基因的肿瘤细胞(1×107个/毫升)直接接种于荷瘤小鼠皮下或肿瘤组织局部。本专利技术取得的技术进步在于本专利技术不同于其他治疗使用的细胞因子，白细胞介素-23主要作用于免疫应答初期，活化树突状细胞以诱导自然杀伤细胞的活化。将白细胞介素-23基因导入细胞通过产生白细胞介素-23发挥较强的抗肿瘤效果，而且白细胞介素-23可诱导记忆性T细胞增殖与活化，分泌IFN-γ，调节免疫功能、抑制肿瘤部位血管的生成，达到治疗肿瘤效果。实际上是伴随着树突状细胞的活化产生肿瘤特异性获得性免疫应答反应，而且在T细胞缺乏的裸鼠，投入含白细胞介素-23基因的肿瘤细胞后也显示了显著的抗肿瘤效果。附图说明图1 CD40配体刺激树突状细胞分泌白细胞介素-23 p40亚单位示意图。图2 CD40配体刺激树突状细胞表达细胞因子示意图。图3活化的树突状细胞白细胞介素-23 p19和p35亚单位表达的比较示意图。图4白细胞介素-23基因插入的结肠癌细胞其细胞白细胞介素-23 p19和p35亚单位表达的比较示意图。图5插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果示意图。图6插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果(2)示意图。图7插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果(3)示意图。图8插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果(4)示意图。图9拒绝白细胞介素-23基因插入结肠癌细胞的小鼠脾细胞IFN-γ产生示意图。图10插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞在裸鼠中的抗肿瘤效果示意图。图11插入白细胞介素-23基因的AcPC-1细胞其白细胞介素-23 p19、p40亚单位分子的基因表达示意图。图12插入白细胞介素-23基因的AcPC-1细胞接种裸鼠后的抗肿瘤效果示意图。图13插入白细胞介素-23基因的AcPC-1细胞接种SCID小鼠后的抗肿瘤效果示意图。图14裸鼠脾细胞的细胞杀伤活性示意图。具体实施例方式以下结合附图对本专利技术的实施例做进一步描述本实施例的整体构思如下所述的载体选用逆转录病毒。利用逆转录病毒为载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞包括以下步骤(1)采用异硫氢酸胍一步法从小鼠脾细胞中提取组织总RNA；(2)将通过逆转录聚合酶链反应法获得小鼠白细胞介素-23p19和p40cDNA，将获得的cDNA插入TA Cloning试剂盒中的Pcr2.1载体，并行聚合酶链反应后用DNA测序仪进行测序验证cDNA的正确性；将验证序列后的cDNA用限制性核酸内切酶和DNA连接酶将其插入病毒载体；(3)利用试剂盒(美国invitrogen公司产品)将步骤(2)获得的病毒载体导入包装细胞，该包装细胞能将病毒载体包装成完整的病毒并将其分泌到培养上清中；(4)收集步骤(3)培养上清，加入65％融合生长PA317细胞的培养皿中，加入四聚季胺(终极浓度8μg/ml，sigma公司产品)；37℃培养5.5小时后弃去上清，加入新鲜培养基继续培养24小时，收集并调整细胞浓度为1×106个/毫升，以10倍，100倍，1000倍，10000倍稀释培养基后，加入培养皿中继续培养并加入新霉素(终极浓度为600μg/ml)进行筛选，待单个细胞长成克隆，分别以37℃、5％CO2和相同细胞浓度培养各个克隆细胞并收集培养上清，以RNA印迹法鉴定转染是否成功及表达量的高低，选择高表达白细胞介素-23的PA317细胞的培养上清，以相同方法感染结肠癌细胞，选择高表达白细胞介素-23的结肠癌细胞，建立结肠癌细胞/白细胞介素-23的第1、4、9、12号克隆肿瘤细胞。所述的限制性核酸内切酶选用Ecol RI和Bam HI。试剂盒选用lipofectamine试剂盒(Invitrogen公司产品)。包装细胞选用φ-2包装本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有转白细胞介素－２３基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于利用载体将白细胞介素－２３导入肿瘤细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田川雅敏，单保恩，
申请(专利权)人：单保恩，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]