基因的一个碱基置换SNP与点突变的检测方法、检测装置及其检测芯片制造方法及图纸

在空间部Ｓ的底面上形成多个金电极８，在该金电极８上固定有不同基因序列所形成的寡核苷酸１０，向配置不与该金电极８接触的共同电极１６构成的、用于基因的一个碱基置换ＳＮＰ和点突变的检测芯片２内的空间部Ｓ内添加样品ＤＮＡ，在共同电极１６和金电极８之间施加电压，检测电流，可检测、分析杂交的双链ＤＮＡ。可以多个样品ＤＮＡ为对象，高感度地检测、分析大量的一个碱基置换ＳＮＰ和点突变。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因表达等方面能够检测并分析DNA基因中一个碱基置换SNP(单核苷酸多态性人遗传密码中的变种)与点突变，即基因中一个碱基置换SNP和点突变的检测方法、检测装置及检测芯片装置。
技术介绍
所谓一个碱基置换SNP就是指人的DNA在1000bp和2000bp之间其碱基序列中就有一个碱基发生变化，对于人来说不论是正常人还是病人通常认为有数十万乃至数百万个SNP，因此人们期待着它能作为一种揭开病因有效预防疾病的一种标志物。所谓点突变就是在已知的基因中其碱基序列有一个碱基发生改变，并且由于这个碱基变化而翻译成蛋白质的功能发生异常，有时它会成为一种疾病的原因。作为测定分析DNA基因碱基序列差异的一种手段，通常使用DNA序列测定法(决定碱基序列的方法)，PCR-SSCP(聚合酶链反应单链多态性(Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism)法，等位基因特异杂交法，DNA芯片法等。DNA序列测定方法有化学降解法(Maxam-Gilbert法)和Sanger双脱氧终止法(即酶法)，但现在主要使用双脱氧终止法，通过PCR法(聚合酶链反应法)使人基因待分析的片段扩增，用2种引物进行序列分析一种是使用PCR法的引物，另一种是设定在扩增DNA内的引物，从而来决定该基因片段内的基因顺序。用不同样品DNA进行这样程序操作来检测基因的一个碱基置换SNP和点突变。PCR-SSCP(Polymerase chain reaction-single stranded polymorphism)法用PCR法扩增人基因待分析的片段，在高温下变形成为单链，并把它放在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳使PCR法扩增双链DNA中的每个单链均形成二次结构(分子内氢键)，根据泳动距离的差异检测基因的一个碱基置换SNP和点突变。在等位基因特异杂交法中，就是通过PCR法扩增待分析基因片段，在膜(尼龙膜)的区域内制作20个左右碱基的PCR产物或寡核苷酸探针，使之标记上的放射线同位素32p样品DNA(被检DNA)进行杂交。通过调控杂交温度等条件，根据放射性同位素的强弱之差来检测基因的一个碱基置换SNP和点突变。DNA芯片法其原理几乎与等位基因特异杂交法一样，就是将20个左右碱基的PCR产物或寡核苷酸探针固定在一定的位置上(基盘上)，使之标记荧光的DNA样品(被检DNA)进行杂交。通过调控杂交温度等条件，根据荧光强弱之差来检测人基因的一个碱基置换SNP和点突变。当进行等位基因特异杂交法中的杂交时为了用放射性同位素标记DNA，使用放射性同位素和保存放射性同位素都需要非常大的开支。当进行DNA芯片法时，用荧光色素标记时，由于荧光色素有很大的分子结构即使足够的频率也无法遮盖住DNA，所以荧光标记探针的荧光强度不高，另外荧光的退色及在基盘上如玻璃等上沾有的荧光色素(一部分背景有荧光)都将成为问题。为了解决上述几个问题，在特开平9-288080号公报及第57次分析化学讨论会论文集(P137-138,1996年)公开了一种方法，其方法既简单又具有高度灵敏性，它是用来检测DNA杂化物的形成和检测双链DNA的方法，即把探针DNA固定于电极上，在嵌入体存在的情况下使这个探针DNA与样品DNA反应，通过电化学作用检测双链DNA并检测杂化物。但是，基因的一个碱基置换SNP和基因突变的数量之大，例如就人来说，为了制作15KB密度(分辨率)的一个碱基置换SNP基因图，必须至少鉴定200万个碱基置换SNP。而且有关已知疾病的基因点突变数目极其多。把所有的一个碱基置换SNP和点突变网罗起来分析用现有的方法几乎是无法实现的。本专利技术的目的就是为了解决上述的问题，以多个样品DNA为研究对象，提供一种一个碱基置换SNP和点突变的装置，它可以检测并分析大量的碱基置换SNP和点突变，既能快速大量处理又能高度灵敏性地进行检测和分析。也就是说，本专利技术就是要基于在特开平9-288080号公报记载的电化学进行双链DNA检测与杂化体的检测的原理，实现一种大量且高度敏感性地检测和分析一个碱基置换SNP和点突变的检测和分析装置。专利技术的概述本专利技术为了解决上述课题，提供一种用于基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测芯片，包括能够添加和除去样品DNA的密闭内部空间，在该空间底部形成的测定电极即多个金电极，在所述空间部配置的不与所述金电极接触的对极即共同电极；在所述金电极上，固定有不同基因序列所形成的PCR产物或寡核苷酸，在所述共同电极和所述金电板之间施加电压，能够测出电流。为了解决上述课题，本专利技术还提供一种基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置，包括能够添加和除去样品DNA的密闭内部空间，在该空间底部形成的多个金电极，在所述空间部配置的、不与所述金电极接触的共同电极，可在所述共同电极和所述金电极之间施加电压并能够测出电流的测定装置；在所述金电极上，固定有不同基因序列所形成的PCR产物或寡核苷酸。也可以将所述内部空间、所述金电极和所述共同电极都包含在检测芯片内，使所述检测芯片能够拆装自如地安装在上述检测装置上，并能与其电连接。也可以通过珀耳帖(Peltier)元件变换所述检测芯片的温度，控制上述杂交温度条件。为了解决上述课题，本专利技术提供一种基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测方法，其方法为，在空间部内添加样品DNA或从样品DNA扩增的基因DNA，使之进行杂交形成双链，再向上述空间部内添加含有电化学活性分子的电解质，调控温度使电化学活性分子与上述双链结合，在所述共同电极和所述金电极之间施加电压，检测流过的电流值，从而检测样品DNA的一个碱基置换SNP和点突变。附图的简要说明附图说明图1是说明本专利技术的检测基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置的实施例的整体构造的立体图； 图2是说明本专利技术的用于检测基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测芯片的实施例的整体构造的立体图；图3是说明图2的检测芯片的使用状态的立体图；图4是用于说明本专利技术的基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置及检测芯片的电极及配线等的结构的图。本专利技术的最佳实施方式为了更详细地阐述本专利技术，按照实施例参照附图进行说明。本专利技术基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测方法、检测装置以及检测芯片的实施方式如图1所示，本专利技术基因的一个碱基置换SNP和点突变的检测装置1由杂交用检测芯片2和测定装置3构成，其测定装置3把检测芯片2插入之后，可以检测分析杂交形成的双链DNA。在图2中，检测芯片2由陶瓷或合成树脂材料等形成卡式或盒式芯片，它由主体部4和自上方装在该主体部4上的上盖5(图中用假想线表示)构成。该检测芯片2用抗酸性及抗碱性的材料作成，特别优选的是上盖5是透明的，从外面可以观察到内部。在主体部4的大致中央处，形成有长方形的凹槽6。将上盖5装在主体部4上而形成一体时，该凹槽部分就成为密闭的空间部S。在空间部S的底面，即在凹槽6的底面7上，距阵状排列、蒸镀金的点，形成一种由多个金电极8构成的阵列金电极9。图2的右侧显示金电极8的放大图，如该放大图所示，对于PCR产物、5′末端寡核苷酸来说，巯基化导入SH基使之成为SH化寡核苷酸10，它被固定在金电极8上。PCR产物是双链DNA，使一本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于基因的一个碱基置换ＳＮＰ和点突变的检测芯片，包括：能够添加和除去样品ＤＮＡ的密闭内部空间部，在该空间部的底面上形成的测定电极即多个金电极，在所述空间部中配置的、不与所述金电极接触的对极即共同电极；其特征在于：在所述金电极上，固定有不同基因序列所形成的ＰＣＲ产物或寡核苷酸，在所述共同电极和所述金电极之间施加电压，并检测电流。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：宫原孝俊，内田和彦，竹中繁织，
申请(专利权)人：内田和彦，竹中繁织，凸版印刷株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]