基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（1）根据待测基因序列设计并选取特异性引物；将特异性引物加入含有所测样本、双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）的混合液中，进行单碱基延伸反应使特异性引物末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷对（dNTP）中的碱基；所述特异性引物位于待测基因SNP位点的上游，且引物的3′-末端碱基紧靠待测SNP位点，含有待测基因序列15～45个连续的核苷酸组成连续核苷酸序列；（2）测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余双脱氧核苷酸三磷酸（ddNTP）或三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）的多少判断该靶基因多态性的类型。该方法成本低、操作简便、不需复杂优化步骤即可快速检测基因多态性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因多态性检测
，具体涉及一种。
技术介绍
国际人类基因组计划(HGP)完成之后，科学家在破译人类基因组的过程中发现， 任何两个不同个体的基因组序列都有约0. 的差异。这种基因序列差异被称为基因多态性，其中最普遍的是单个核苷酸的差异，即单核苷酸多态性(SNP)，占所有已知多态性的 90% 以上Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001,409(6822) :860-921.。基因多态性决定了不同人种和群体的差异，以及不同人群疾病易感性和药物治疗敏感性的差异。因此，基因多态性尤其是SNP可成为疾病发生和药物反应相关基因，进行疾病预防、诊断和临床用药指导的基础Brown P0, Hartwell L. Genomics and human disease—variations on variation. Nat Genet 1998，18(2) :91-93.。通常，SNP是一种双等位基因，即在该位置上存在两种不同的碱基。因此，对已知 SNP位点的检测就是进行两种不同类型碱基的确认分析，而无须对DNA片段进行全序列测定。目前，已经发展了多种检测SNP的方法，这些检测方法主要包括两个部分，即检测原理和检测平台。检测原理主要包括引物延伸反应、内切酶酶切反应、连接酶酶连反应、构象和杂交；而检测平台主要有电泳、高效液相色谱、荧光、芯片和质谱分析等汪维鹏，倪坤仪，周国华.单核苷酸多态性检测方法的研究进展.遗传，2006 二8(1) :117-126.。这些技术虽然在某种程度上能完成对SNP的检测，但应用上还存在很多不足，有些检测过程繁琐，需要多步反应，费时费力，如限制性片段长度多态性(RFLP)分析Cohen JB, Levinson AD. A point mutation in the last intron responsible for increased expression and transforming activity of the c—Ha—ras oncogene. Nature 1988， 334(6178) :119-124.；有些技术需要多种昂贵的试剂，如焦测序技术Ronaghi Μ, Uhlen M，Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science 1998， 281 (5375) :363,365.；有些技术设计复杂，如引物入侵技术Lyamichev V，Mast ALiHall JG, et al. Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes. Nat Biotechnol 1999,17(3) 292-296.；有些技术对反应条件要求很高，难于控制，容易出现非特异性反应产物，如等位基因特异性扩增(ASA)Sommer SS, Groszbach AR, Bottema CD. PCR amplification of specific alleles (PASA) is a general method for rapidly detecting known single-base changes. Biotechniques 1992,12(1) :82-87.和等位基因特异性杂交(ASO) 等Tsuji S,Martin BM,Barranger JA,et al. Genetic heterogeneity in type 1 Gaucher disease :multiple genotypes in Ashkenazic and non-Ashkenazic individuals. Proc Natl Acad Sci U S A 1988,85(7) :2349-2352.；还有些技术需要对核苷酸进行荧光、同位素或酶标记，这就需要采用相应的检测平台进行检测，使得检测成本大大提高，如 TaqMan探针技术Livak KJiMarmaro JiTodd JA. Towards fully automated genome-wide polymorphism screening. Nat Genet 1995,9(4) :341-342.和 SNP 芯片技术Fan JB， Chen X，Halushka MK, et al· Parallel genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res 2000,10(6) :853-860.等。 在上述技术中，单碱基延伸反应原理简单、特异性好，即设计一条引物位于待测 SNP位点的上游，该引物的3 ‘-末端碱基紧靠待测SNP位点，加入标记的ddNIPs进行反应， 只有当加入的ddNTP与SNP位点碱基互补时，引物才得以延伸，通过检测引物延伸产物来判断SNP的类型；但该技术仍需要对ddNIPs进行标记，大大增加了检测成本。本专利技术因此而来。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种，解决了现有技术中单碱基延伸反应检测时需要ddNIPs进行标记造成检测成本增加、荧光标记检测结果受荧光性质的影响等问题。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术提供的技术方案是一种，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)根据待测基因序列设计并选取特异性引物；将特异性引物加入含有所测样本、双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)的混合液中，进行单碱基延伸反应使特异性引物末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷对(dNTP)中的碱基；所述特异性引物位于待测基因SNP位点的上游，且引物的 3'-末端碱基紧靠待测SNP位点，含有待测基因序列15 45个连续的核苷酸组成连续核苷酸序列；(2)测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)的多少判断该靶基因多态性的类型。优选的，所述方法中进行单碱基延伸反应的单碱基延伸反应液终浓度组成为单碱基延伸反应缓冲液终浓度1 10X ；ddNTP 或 dNTP0. 01 1. 5mM单碱基延伸反应的DNA聚合酶 0. 01 1. OU/ μ L ；特异性引物序列终浓度为0. 01 2 μ M ；MgCl2终浓度为 0.5 5mM。优选的，所述方法中测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量的方法选自高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)或微流控芯片电泳(MCE)方法。优选的，所述方法中在步骤⑴进行单碱基延伸反应前进行PCR扩增待测基因样本，进行单碱基延伸反应使用的所测样本采用PCR扩增后的待测基因样本。优选的，所述方法中双脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种基于单碱基延伸反应进行基因多态性检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（１）根据待测基因序列设计并选取特异性引物；将特异性引物加入含有所测样本、双脱氧核苷酸三磷酸对（ｄｄＮＴＰ）或三磷酸脱氧核糖核苷对（ｄＮＴＰ）的混合液中，进行单碱基延伸反应使特异性引物末端加入一个双脱氧核苷酸三磷酸对（ｄｄＮＴＰ）或三磷酸脱氧核糖核苷对（ｄＮＴＰ）中的碱基；所述特异性引物位于待测基因ＳＮＰ位点的上游，且引物的３′－末端碱基紧靠待测ＳＮＰ位点，含有待测基因序列１５～４５个连续的核苷酸组成连续核苷酸序列；（２）测定延伸产物中剩余核糖核苷酸的量；根据延伸产物中剩余双脱氧核苷酸三磷酸（ｄｄＮＴＰ）或三磷酸脱氧核糖核苷（ｄＮＴＰ）的多少判断该靶基因多态性的类型。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪维鹏，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32