[课题]确立一种能有效地检测VKORC1基因的第-1639位碱基的多态性的淬灭探针，并提供一种检测VKORC1基因的第-1639位碱基的多态性的方法，以及用于该方法的试剂盒。[解决手段]一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测VKORC1基因的第-1639位的多态性的探针，所述探针由寡核苷酸构成，该寡核苷酸为序列号1或序列号2所示的碱基序列中包含碱基序号80～89的10～50个碱基长度的碱基序列，该寡核苷酸除了对应于序列号1或序列号2中第80号碱基的碱基为胞嘧啶以外与序列号1或序列号2具有同源性，且对应于碱基序号80的碱基被荧光染料标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及VKORCl基因的第-1639位碱基的多态性检测方法、以及用于该方法的核酸探针和试剂盒。
技术介绍
对于心肌梗塞、脑梗塞患者，广泛使用华法林(warfarin)作为防止血液凝固的药物。华法林的适用量根据人种而有大的差异，进而，即便是相同人种，个体间也显示出差异。 若过量投与华法林，则有可能发生例如鼻出血、皮肤内出血，或者有时还会发生颅内出血等副作用。因此，在治疗中对各个患者分别确定华法林的适当用量变得极为重要。在确定这样的华法林的适用量值之际，近年来，有报道称CYP2C9基因和VKORCl 基因的多态性关系到华法林的药效(非专利文献1、幻。CYP2C9基因是编码用于制备华法林代谢酶的细胞色素P450的基因。VKORCl基因是编码作用于维生素K的蛋白质的基因， 该维生素K参与血液的凝固。因此，检测出这两种基因的多态性对于相应于患者来确定华法林的适用量、并减少副作用而言也是非常重要的。另外，作为VKORCl基因的多态性，已知 1173C > T(rs9934438)、-1639G > A(rs9923231)等。这些 VKORCl 基因的多态性记载于非专利文献3 5中。作为检测碱基的多态性的方法，有PCR-RFLP法(聚合酶链_限制性长度多态性分析)(非专利文献幻或利用焦磷酸测序(pyrosequencing)技术来检测突变的方法(非专利文献4)。然而，非专利文献3的PCR-RFLP法需要花费功夫和成本，例如在进行DNA的提取纯化和PCR后，需要对扩增产物进行限制酶处理、进行电泳等。另外，由于在进行PCR后需要进行扩增产物的处理，因此有扩增产物混入下一反应体系之虞，存在难以自动化、无法同时检测多个核酸序列的问题。非专利文献4的焦磷酸测序是基于如下原理的，即，通过将核苷酸被引入DNA时所释放的焦磷酸转变成ATP来用于发光反应，从而能够定量有多少核苷酸被引入DNA中。实际上，是通过每次加入一种脱氧核糖核苷酸测定发光量后将之除去并重复进行这种操作， 从而确定序列的。作为除去过剩核苷酸的方法，有固相化法，其将模板DNA结合到某些固相基质上，通过用反应液冲洗来除去过剩核苷酸；和液相法，其通过加入腺苷三磷酸双磷酶 (apyrase)来分解核苷酸。虽然有自动进行这些繁杂作业的系统在售，但价格非常昂贵，需要成本。另外，存在必须进行DNA的提取纯化、前处理等，需要花费功夫和成本的问题。另一方面，已知有通过PCR(聚合酶链反应)对包含突变的区域进行扩增后，使用荧光染料标记的核酸探针进行融解曲线分析，并基于融解曲线分析的结果来解析突变的方法(专利文献1、幻。然而，在这些文献中，关于探针的设计仅有如下教导，即，应将探针设计成当使末端部被荧光染料记的淬灭探针与目标核酸杂交时，在末端部，探针-核酸杂交体的多个碱基对至少形成一个G-C对(pair)。专利文献3中记载有，使用5’末端荧光标记的探针，通过融解曲线分析来同时检测VKORCl 1173C > T (rs9934438)和CYP2C9*3的方法。但是，并没有记载检测 VK0RC1-1639G > A (rs9923231)的多态性的方法。另外，也没有记载同时检测VK0RC1-1639G > A(rs9923231)的多态性和CYP2C9*3突变位点的多态性的方法。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2001-286300号公报专利文献2 日本特开2002-11拟91号公报专利文献3 国际公开公报W0/2008/117782非专利文献 1 :Simone Rost et al. , Nature Vol. 427 20041etters to nature2 :Mark J. Rieder et al. ， The New England Journal of Medicine 352 ；22，2005非专利文献3 :TDM 研究 Vol. 25 No. 4(2008) 141-144非专利文献4 :BL00D，1 SEPTEMBER 2007 VOLUME 110，NUMBER 5非专利文献5 =Genet Med. 2008 Feb ； 10 (2) :89-98
技术实现思路
。专利技术要解决的问题本专利技术的课题在于确立一种能有效地检测VK0RC1基因的第-1639位碱基的多态性的淬灭探针，并提供一种检测VK0RC1基因的第-1639位碱基的多态性的方法，以及用于该方法的试剂盒。用于解决问题的方案本专利技术人发现通过基于VK0RC1基因的包含第-1639位碱基的多态性的特定区域设计淬灭探针，并进行使用该淬灭探针的融解曲线分析，从而能够检测出该突变，至此完成了本专利技术。S卩，本专利技术如下所述。(1) 一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测VK0RC1基因的第-1639位碱基的多态性的探针，所述探针由寡核苷酸构成，该寡核苷酸为序列号1或序列号2所示的碱基序列中包含碱基序号80 89的10 50个碱基长度的碱基序列，该寡核苷酸除了对应于序列号1或序列号2中第80号碱基的碱基为胞嘧啶以外与序列号1或序列号2具有同源性，且对应于碱基序号80的碱基被荧光染料标记。(2)根据(1)所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸中，在从5’末端数起第1 3号位置具有被荧光染料标记的对应于碱基序号80的碱基。(3)根据(1)所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸在5’末端具有被荧光染料标记的对应于碱基序号80的碱基。(4)根据(1) C3)任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸当未与目标序列杂交时发出荧光，且当与目标序列杂交时荧光强度减少或增加。(5)根据(4)所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸当未与目标序列杂交时发出荧光，且当与目标序列杂交时荧光强度减少。(6)根据⑴ (5)任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸的碱基长度为10 40。 (7)根据⑴ (6)任一项臓的多态性检测用探针，臓寡核苷酸的藤长度为15 30。(8)根据⑴ (7)任一项腿的多态性检测用探针，腿寡核苷酸的 藤长度为15 25。(9)根据⑴ (8)任一项臓的多态性检测用探针，戶脑探针是融解曲线分析用的探针。(10)根据⑴ (9)任一项所述的多态性检测用探针，所述寡核苷酸以序列号6表示。(11) 一种多态性检测方法，其为使用(1) (10)任一项所述的多态性检测用探针来检测VKORCl基因附近区域的多态性的方法。(12)根据(11)所述的多态性检测方法，该方法包括(I)使(1) (10)任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，从而使所述荧光标记寡核苷酸和所述单链核酸进行杂交来获得杂交产物的步骤；(II)通过改变包含所述杂交产物的试样的温度，从而使所述杂交产物解离，并测定基于所述杂交产物的解离的、荧光信号的变动的步骤；(III)基于所述信号的变动来确定杂交产物的解离温度、即Tm值的步骤；以及(IV)基于所述Tm值，确定VKORCl基因中的多态性的存在或者具有多态性的核酸的存在比的步骤。(13)根据(12)所述的多态性检测方法，该方法还包括在所述步骤⑴之前或与所述步骤(I)同时进行核酸的扩增的步骤。(14) 一种判断华法林的适用量的方法，该方法包括通过(11) (本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测ＶＫＯＲＣ１基因的第－１６３９位碱基的多态性的探针，所述探针由寡核苷酸构成，该寡核苷酸为序列号１或序列号２所示的碱基序列中包含碱基序号８０～８９的１０～５０个碱基长度的碱基序列，该寡核苷酸除了对应于序列号１或序列号２中第８０号碱基的碱基为胞嘧啶以外与序列号１或序列号２具有同源性，且对应于碱基序号８０的碱基被荧光染料标记。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小森真理子，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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