本发明专利技术公开了一种用于实时检测食物中和表面上的沙门氏菌的方法和试剂盒。在分析之前，在培养基中富集沙门氏菌以提高它们的密度。在叠氮化钠、蛋白酶K和清洁剂的存在下通过溶解来回收DNA。使用基因特异引物和可分解嵌合荧光探针在PCR反应中执行沙门氏菌种的实时检测。该方法还描述了内部对照以确定核酸扩增和检测的效率。该方法适用于介质和高批量分析。
【技术实现步骤摘要】
本公开描述了用于实时检测食物中和表面上的沙门氏菌种的方法和试剂盒。
技术介绍
沙门氏菌是杆状的革兰氏阴性肠杆菌。沙门氏菌严格属于埃希氏菌属，并在世界范围内在温血动物、冷血动物和人类中被发现。它们在人类和许多动物中引起诸如伤寒、副伤寒、食物传染疾病和沙门氏菌病的疾病。许多被沙门氏菌感染的人在被感染12小时至72 小时之后发展为腹泻、发热、呕吐和腹绞痛。通常通过培养粪便试样来诊断感染。该疾病通常持续4至7天。虽然多数人未经过治疗就康复，但更严重的感染可能发生。婴幼儿、老年人和免疫系统弱的人比其它人更容易发展成严重的疾病。当严重的感染发生时，沙门氏菌会从肠道扩散到血流然后扩散到身体其它部位，除非使用抗生素迅速地治疗病人，否则可能导致病人死亡。目前，存在两种公认的沙门氏菌种肠道沙门氏菌(S.enterica)和邦戈尔沙门氏菌(S. bongori)，肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌具有六种主要血清型:enterica(I) (肠道(I))、salamae(II)(萨拉姆(II) )、arizonae (IIIa)(亚利桑那(Ilia))、 diarizonae (IIIb)(双亚利桑那(IIIb) )、houtenae (IV)(豪顿(IV))和 indica(VI)(因迪卡(VI))。编码各种毒力因子的多个致病岛(PAI)的存在允许沙门氏菌入侵并感染宿主生物。存在两种重要的PAI，即，编码两种不同的类型III分泌系统的沙门氏菌致病岛1和 2 (SPI-1和SPI-2)，该分泌系统使效应分子进入到宿主细胞中，导致将系统扩散的细菌的内化。邦戈尔沙门氏菌是爬虫类特异的并很少在人类感染中发现。肠道沙门氏菌特异的血清型导致诸如伤寒的更多严重的疾病。各种食物和表面的沙门氏菌污染物被美国农业部食物安全检验局(FSIS)认为是主要的健康危害。沙门氏菌不被冷冻破坏。传统上，通过执行经典的微生物化验来检测食物中和表面上的沙门氏菌，经典的微生物鉴定耗时、劳动强度高、不灵敏、昂贵且难以自动化。随着DNA扩增技术的出现，现在通过表面刮拭试验或者对原料和处理过的食物试样进行核酸分析来对沙门氏菌进行常规检测。现在，大多政府机构选择采用核酸化验作为监控食物加工厂和配送中心的方法。核酸分析不仅进行沙门氏菌的检测、血清型的鉴定还对沙门氏菌的爆发进行跟踪。这样的监控通过监督医院和医药团体改善了公共健康和安全，也允许污染源的快速鉴定和隔离。例如，在2009年，FDA宣布它们已跟踪到鼠伤寒沙门氏菌在美国花生公司(PCA)在佐治亚州的布莱克利拥有的工厂中爆发，并敦促人们推迟食用商业制备或生产的含花生酱的产品和供应该机构的花生酱。据报道，在美国的46个州的至少343个食品公司中的至少 3862个花生酱类产品(诸如饼干、能量棒和花生酱曲奇)中发现了沙门氏菌。狗粮也受到影响。超过46个州中的至少691人产生疾病，并夺去了至少9条生命。由PCA生产的花生酱和花生糊被分发给数以百计的公司，用作诸如曲奇、饼干、谷类食品、糖果和冰激凌的数以千计的不同产品中的成分，这些产品全部被召回。也有一些产品在零售店中被直接地销售给客户。因此，沙门氏菌爆发的围堵政策呈现给政府部门艰巨任务和后勤任务。对沙门氏菌爆发的快速和完全的响应无疑节省了资金，抑制蔓延的疾病，甚至拯救了生命。然而，PCR扩增方法易于出现假阳性(如在WO 95/33854中所述)检测和假阴性(如在 WO 92/01056, WO 95/00664, WO 92/01056, WO 93/04202 中所述)检测。由于前述的原因，对测试样品中的沙门氏菌核酸序列的准确和可靠的实时检测在本领域中的需求仍未得到满足。
技术实现思路
根据实施例，结合PCR和CataCleave技术来设计通过把沙门氏菌种特异侵入基因作为目标来实时检测食物中和表面上的沙门氏菌的试剂盒。根据另一方面，描述了用于监控实时检测反应的方法，以使用核酸序列与沙门氏菌种不相关的内部对照来确定质量控制问题。在一个实施例中描述了用于实时检测样本中沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤提供要被检测的具有沙门氏菌基因目标DNA的样本；提供扩增引物对，该引物对可以退火得到沙门氏菌目标DNA ；提供包含可检测标记的探针及与沙门氏菌目标DNA基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列；在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液的存在下扩增第一扩增引物与第二扩增引物之间的PCR片段，RNAse H活性和探针以及在RNA序列在探针内的情况下RNA序列能够与沙门氏菌目标DNA的PCR片段中的互补DNA序列形成RNA:DNA异源双链体；检测来自探针上的标记的发射信号的实时增加，其中，信号的增加表示在样本中存在沙门氏菌目标DNA。一方面，来自探针上的标记的发射信号的实时增加由在探针与PCR片段的一条链之间形成的异源双链体的RNAse H切割产生。 沙门氏菌目标DNA序列可以包含InvA基因。探针中的DNA序列和RNA序列可以彼此共价连接。探针上的可检测标记可以是诸如FRET对的荧光标记。扩增缓冲液可以是HEPES缓冲液。探针或PCR片段可以连接到固体载体。扩增聚合酶活性可以是热稳定DNA聚合酶的活性，RNAse H活性可以是热稳定RNAse H的活性。RNAse H可以是位点非特异性的或位点特异性的。在实施例中，RNAse H是RNAse H 11。在另一实施例中，RNAse H II来自于Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、 Pyrococcus horikoshi或Thermococus litoralis。样本可包括食物样本或表面刮拭样本。可以使用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理样本中的模板核酸，在PCR扩增之前使尿嘧啶-N-糖基化酶失活以防止遗留物污染。一方面，探针具有SEQ ID NO :7、13或14的序列。另一方面，扩增引物对可以是SEQ ID NO :1和2的引物对、SEQ ID NO :3禾口 4的弓丨物对和SEQ ID NO :5和6的引物对。另一实施例公开了一种实时检测样本中沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤 提供要被检测的具有沙门氏菌目标RNA的样本；提供正向扩增引物和反向扩增引物的引物对，该引物对可以退火得到沙门氏菌invA目标核酸序列；在反转录酶活性和反转录扩增引物的存在下反转录沙门氏菌invA目标RNA来产生cDNA序列；在扩增聚合酶活性存在下扩增第一扩增引物与第二扩增引物之间的目标cDNA序列以产生PCR片段；提供包含可检测标记的探针及与PCR片段基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列，在RNA序列在探针内的条件下的RNAse H活性能够形成RNA:DNA异源双链体，其中，在PCR片段中存在互补序列；检测来自探针上的标记的发射信号的实时增加，其中，信号的增加表示在样本中存在沙门氏菌目标RNA。一方面，来自探针上的标记的发射信号的实时增加由在探针的RNA序列与沙门氏菌目标RNA的cDNA之间形成的RNA:DNA异源双链体的RNAseH切割产生。一方面，扩增引物对可以是SEQ ID NO :1和2的引物对、SEQ ID NO :3和4的引物对或者SEQ ID NO :5和6的引物对。在另一实施例中，公开了本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种实时检测样本中沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤：ａ）提供将要被检测的具有沙门氏菌ｉｎｖＡ基因目标ＤＮＡ的样本；ｂ）提供扩增引物对，该引物对能够退火得到沙门氏菌ｉｎｖＡ基因目标ＤＮＡ，其中，扩增引物对选自于由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和２的引物对、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３和４的引物对和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５和６的引物对组成的组中；ｃ）提供包含能够检测的标记的探针及与沙门氏菌目标ＤＮＡ基本上互补的ＤＮＡ核酸序列和ＲＮＡ核酸序列；ｄ）在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液的存在下扩增第一扩增引物与第二扩增引物之间的ＰＣＲ片段，ＲＮＡｓｅ Ｈ活性和探针以及在ＲＮＡ序列在探针内的情况下，ＲＮＡ序列能够与沙门氏菌目标ＤＮＡ的ＰＣＲ片段内的互补ＤＮＡ序列形成ＲＮＡ：ＤＮＡ异源双链体；ｅ）检测来自探针上的所述标记的发射信号的实时增加，其中，信号的增加表示在样本中存在沙门氏菌目标ＤＮＡ。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：詹森·欧普迪克，张文腾，李俊，
申请(专利权)人：三星泰科威株式会社，
类型：发明
国别省市：KR
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