本发明专利技术公开了一种快速检测山羊同源异型框6(six6)基因单核苷酸多态性(SNP)的方法，以包含Six6基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊Six6基因；用限制性内切酶PstI消化PCR产物后，再进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定山羊Six6基因第232位的基因型(以序列Accession?No.NM_001104993.1为参考)；在动物生产实践中，由于Six6基因单核苷酸变异或SNP对形成胚胎、调控生长激素和促进垂体分泌激素等具有重要的作用，故将该位点不同基因型与生长发育性状数据进行关联分析。结果发现：CT基因型个体的管围显著大于CC基因型个体(P＝0.047)，说明CT基因型可以作为一个提高山羊管围的分子遗传标记。故本发明专利技术提供的快速检测Six6基因SNP的检测方法，在中国山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)育种中，有利于快速建立遗传资源优良的山羊种群。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物分子育种领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测山羊同源异型框Six6基因第232位(以序列Accession No. ΝΜ_001104993. 1 为参考)单核苷酸变异或SNP的方法，及其在动物生长性状的标记辅助选择(MAQ育种中用于快速建立遗传资源优良的山羊种群。
技术介绍
山羊是人类的重要家畜物种资源之一，它在各国社会经济和人们生活中扮演着重要角色。随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，社会对山羊产品的需求不断加强，期望山羊育种专家尽快培育出更早、更好、更快地获得山羊产品的优良品种。在高产、优质和高效的山羊育种目标上，山羊育种专家一直关注生长发育性状，但现在的问题是仅靠传统育种手段不断改良并提高这些性状，显然是不行的，还需要标记辅助选择(MAS)介导的现代分子育种技术的介入。数量遗传学理论指出，生长性状是山羊有重要经济价值的数量性状之一，由微效多基因控制，其遗传力较低，所以仅用常规育种手段对其改良、提高时遗传进展无疑是非常缓慢的，且效果不会理想。DNA标记的出现为加速生长性状的遗传进展提供了可靠的手段和有力的保障，使标记辅助选择(MAQ育种成为一种具有广阔前景的分子育种技术，因为DNA标记具有“多态性丰富、遗传稳定、不受组织、生理发育阶段及环境影响” 等诸多优点。为此，借助现代先进的MAS育种手段对我国山羊品种进行卓有成效的遗传改良，找到山羊生长发育性状的分子标记，是提高我国山羊生产水平，尤其是发育速度的根本途径。然而目前，在利用MAS育种技术改良山羊生长发育性状的实践中，首先需要在DNA水平上筛查和检测与山羊生长发育性状密切相关的DNA标记，其次是建立基因多态性的快速检测方法，然后是基因多态与生长发育性状数据进行数量遗传学分析，从而实现MAS和实现早期诊断选择。在山羊生长发育性状的MAS育种中，研究DNA标记与目标性状之间的关系，有两种基本方法候选基因分析和连锁标记分析。在动物研究中，候选基因分析比连锁标记分析更易操作，且不需要进行特意实验设计、费用低、统计功效强，被广泛采用，适用于任何可取得基因型和表型数据的群体。该方法通过统计方法建立相应的数学模型，从而确定该候选基因与未知基因的关系或效应。一般而言，候选基因通常是一些与研究性状生长发育过程有关的基因，可能是结构基因、调节基因或是在生化代谢途径中影响该性状表达的基因。在本专利技术中，Six同源框(Six-homeobox)基因家族符合山羊生长发育性状的重要候选基因的要求。Six同源框基因家族是一类处于哺乳和脊椎动物垂体内的核心转录调控因子，被命名为Six基因Wajima et al，2010)。目前在小鼠、人、鸡、青蛙、线虫和果蝇等物种中均已鉴定出该类基因。至今，在脊椎动物中已发现了至少6个成员因子Sixl、Six2、Six3、 Six4、Six5和Six6，分为3大亚家族，即Sixl/2、Six3/6和Six4/5。该家族基因所编码氨基酸的结构域基本相似，分为N-端结构域(NT)、Six蛋白互作域(SD)、Homeobox同源结构域 (HD)和C-端结构域(CT)。2009年，Kumar等揭示了该家族基因所编码的转录因子在胚胎发育、细胞分化、垂体前叶正常发育、垂体机能衰退、癌症和肿瘤等方面发挥着重要的作用。作为Six家族中一个新同系物成员，Six6基因(又名0PTX2和Six9)与Six3基因紧密相关，其编码氨基酸含有两个高度保守的HDs结构域和SDs结构域。人Six6基因定位于染色体14q22. 3_q23，DNA序列全长2567bp，含有2个外显子和一个内含子，共编码246个氨基酸。牛Six6基因定位于10号染色体上，DNA序列全长共2574bp，包括3个外显子和2 个内含子，共编码222个氨基酸。Six6基因的主要功能是调控垂体早期特克氏囊中细胞分化及垂体前叶细胞的形成，为是一个缺陷相关的重要候选基因。Six6基因的表达比较不广泛，主要表达在发育的下丘脑、垂体等区域。已有研究表明，缺乏Six6转录因子的动物常会出现垂体发育不全和视网膜与视神经缺陷等症状；在正常发育过程中，Six6主要作用机理是通过与辅阻遏蛋白Tlel和Dachl互作来抑制P27Kipl启动子，而该启动子自身就是胚胎发育中垂体前体细胞分化和视网膜的抑制剂；feillardo等Q001)揭示Six6基因的缺失或单倍剂量不足，都将会导致垂体异常和双边无眼畸形。在成年鼠大脑中，Six6基因与Six3 基因在胚胎发育早期的神经板区域重叠表达，随着胚胎的发育开始分离成不同的区域，其中，Six6则主要分布在丘脑和小丘脑区域，提示Six6在脑发育过程中具有重要作用(Conte et al.，2005)。单核苷酸多态性(SNP)是指DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异，在人群中这种变异的发生频率至少大于1%，它是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90%以上。由于SWs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3 个或4个等位基因的SNPs极其罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。根据SNI3s在基因组中分布的位置，可分为基因编码区SNPs (cSNPs)、基因周边SNPs (pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总体而言，cSNP比较少，又分为同义cSNPs和错义cSNPs，而 PSNP和iSNP较多。就SNP得生物功能而言，错义cSNPs涉及碱基序列的改变，将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能；同义cSNP虽然未能改变目的蛋白质的氨基酸序列，但有研究显示同义突变会影响目的蛋白质的翻译效率，进而对基因功能产生重要影响；pSWs和iSWs产生功能的机制主要是影响转录因子与启动子的的结合能力从而调控基因的转录，或者内含子区域SNP产生功能的分子机制是与附近其它基因SNP连锁或者可能影响mRNA的剪接从而影响蛋白质的功能。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。 因此，SNP在遗传病和育种的研究中却具重要意义，倍受动物育种专家的青睐。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs 即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与 DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核苷酸连接反应、PCR-RFLP和引入突变位点的-PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等(Liu et al，2010)。在这些 SNP 检测技术中，DNA 序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，故DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种快速检测山羊Ｓｉｘ６基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含Ｓｉｘ６基因的待测山羊全基因组ＤＮＡ为模板，以引物对Ｐ为引物，ＰＣＲ扩增山羊Ｓｉｘ６基因；用限制性内切酶ＰｓｔＩ消化ＰＣＲ扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊Ｓｉｘ６基因第２３２位的单核苷酸多态性，所述的引物对Ｐ为：上游引物：５’ＴＣＣＴＣＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＧ－３’ １７ｎｔ；下游引物：５’－ＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＴＧＣ－３’２６ｎｔ。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含Six6基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊Six6基因；用限制性内切酶I3StI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊Six6基因第232位的单核苷酸多态性，所述的引物对P为上游引物5 ’ TCCTCCAATCCCTCCCG-3 ’17nt ；下游引物5，-AACATCGAGGCAGCGCCGGCGACTGC-3，26nt02.如权利要求1所述的快速检测山羊Six6基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于， 所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性5min ；35个循环94°C变性30s，51. 6°C退火30s，72°C延伸30s ；72°C延伸 IOmin03.如权利要求1所述的一种快速检测山羊Six6基因单...
【专利技术属性】
技术研发人员：蓝贤勇，潘传英，陈宏，淮永涛，雷初朝，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61
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