一种特异性指示禽粪便污染的基因检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性指示禽粪便污染的基因检测方法，包括从水域中提取待测水样DNA；用特异性引物荧光定量PCR选择性扩增样品DNA；将扩增产物核苷酸序列与基因标记Av-Bac核苷酸序列进行比对的步骤。本发明专利技术将基因标记Av-Bac用于水体中禽源粪便污染（非点源污染）的溯源，具有显著的宿主特异性，正确判别率可达100%。并可定量检测禽粪便污染情况，从而能正确评估其污染贡献率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境生物
，具体涉及。
技术介绍
随着沿海养殖业的发展，农业非点源污染——畜禽排泄物污染已成为影响近海海域及养殖水体环境质量的重要污染源。畜禽养殖排泄物多以非点源的方式进入水体环境， 其随机性、散在性、广泛性和多样性给管理和控制造成了巨大困难。动物粪便带来的大量致病微生物，诸如霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、肠兰伯氏鞭毛虫、甲型肝炎病毒、贝类Norwalk病毒等可以随着污染的水体到处传播。部分细菌或病毒能够直接作用于海洋动植物，导致鱼类或贝类等水产养殖品大量死亡；部分致病菌还可以存活于贝类或鱼类体内，通过食物链进入人体，造成流行病传染病的暴发。由此可见，粪便污染不仅给水产养殖业和海洋生态环境带来危害，而且还威胁着人类的健康生活。治病要去根，治污当溯源。建立监测、溯源和示踪为一体的近岸海域及养殖水环境非点源污染示踪监测体系势在必行。为了解决农业粪便污染对水环境带来的污染问题，以美国为代表的先进国家开始了一种新型识别粪便污染源技术——微生物源示踪(Microbial Source Tracking, MST) 的研究。MST是指利用微生物为污染源的示踪指示物，识别污染环境中污染物(特别是粪便) 来源的生物技术。MST监测的优势主要体现在1)准确识别环境水域中非点源污染，特别是粪便污染的来源；2)正确评估非点源污染水体的污染贡献率；3)明确各已知污染源与病原微生物和污染危害之间的相关性；4)用于预测各已知污染源污染物的迁移化规律和扩散途径。微生物源示踪的具体方法可分为依赖数据库型(library-d印endent methods, LDMs)和非依赖数据库型(library-ind印endent methods, LIMs)两大类。LDMs方法是利用不同宿主来源指示微生物(如五cWi)表型或基因型的差异建立相应数据库，并参照数据库信息判别未知宿主来源的指示菌，从而追溯粪便污染的来源；包括抗生素耐药法、脂肪酸分析法、核糖体法、脉冲场电泳法、rep-PCR指纹分析法等。LIMs方法主要依赖于宿主特异性分子标记的检测，关键在于筛选针对不同动物宿主的特异性标记。目前研究较为成熟且应用广泛的是LDMs，然而此类方法需要大量菌株的分离纯化及相关特性数据库的建立，耗时耗力且具有区域局限性；因此，基于宿主特异性标记检测的LIMs方法越来越受到关注。近年来研究发现，宿主特异性拟杆菌属(ifecteroiW^) 16S rRNA基因标记的检测可有效用于指示人源和动物源粪便污染，是一种理想的LIMs方法。已有研究筛选得到特异性指示人、狗、牛和猪粪便污染的fecteroii/a^^s 16S rRNA基因标记(Kildare et al.， 2007，Water Res. 41:3701 - 3715; Layton et al., 2006, App1. Environ. Microbiol. 72:4214 - 4224; Mieszkin et al. , 2009, App1. Environ. Microbiol. 75:3045 -30 ),而特异性指示禽粪便污染的fecteroii/a^^ 16S rRNA基因标记未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过系统进化分析禽粪便拟杆菌属(Macteroidales) 16S rRNA 序列，获得一种特异性指示禽粪便污染的基因标记Av-Bac，最终将该基因标记应用于水体中禽源粪便污染的溯源。，其特征在于，包括以下步骤a)从水域中提取待测水样DNA;b)用荧光定量PCR扩增样品DNA;其中，引物核苷酸序列为 正向引物 Av-BacF: 5’- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3’反向引物 Av-BacR 5 ’ -CGCCCATTGACCAATA-3 ’探针序列为FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA ；c)将上述扩增产物核苷酸序列与下述核苷酸序列进行比对Av-Bac 5'-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GMGG TCCCC CACAT TGGM CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3，若二者核苷酸序列相同，且该序列平均浓度为每毫升样品中含2. 5士0. 3 Iogltl拷贝，则该水域判断为受禽粪便污染的水域。进一步地，步骤b中，荧光定量PCR反应的引物浓度为300 nmol，探针浓度为200 nmol ο步骤b 中，荧光定量 PCR 反应程序为95 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45个循环，在每个循环退火、延伸阶段收集荧光信号。本专利技术还提供了一种用于上述基因检测方法的引物，其特征在于，该引物序列为正向引物 Av-BacF: 5，- CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3，；反向引物 Av-BacR: 5’ -CGCCCATTGACCAATA-3’。本专利技术中的基因标记Av-Bac是通过系统进化分析得到，具体方法如下 (一)拟杆菌属UacteroiWe1S) 16S rRNA基因序列系统进化分析采集我国东海近岸部分海域周围主要养殖禽类和海鸟粪便样品，并提取粪样DNA ； 利用引物Bac32F/Bac708R选择性扩增Bacteroichles 16S rRNA基因，获得禽源 Bacteroidales 16S rRNA基因文库；将23个代表性序列与GenBank中16S rRNA序列同源性比对，构建系统进化树(图1)，并获得1个禽类特异性序列聚类簇Cluster A。(二)特异性指示禽粪便污染基因标记(Av-Bac)的引物与序列特征根据上述Cluster A中的序列比对，设计用于荧光定量PCR检测的引物和探针， Av-BacF: 5’ - CTTCGATGGATAGGGGTTCT-3’ Av-BacR: 5' -CGCCCATTGACCAATA-3‘ Av-BacProbe FAM-GAACTGAGACACGGTCC-TAMRA上述引物扩增片段长度为103 bp，即为特异性指示禽粪便污染基因标记Av-Bac，其核苷酸序列为5’-CTTCG ATGGA TAGGG GTTCT GAGAG GAAGG TCCCC CACAT TGGAA CTGAG ACACG GTCCA AACTC CTACG GGAGG CAGCA GTGAG GAATA TTGGT CAATG GGCG-3， (三)应用Av-Bac荧光定量PCR检测样品的特异性评价将Av-Bac标记用于荧光定量PCR检测58个已知来源的粪样(包括猪、牛、羊、狗、鸡、鸭、鹅、海鸟来源)，real-time PCR反应时Av-BacF/ Av-BacR最佳浓度为300 nmol， Av-BacProbe 最佳浓度为 200 nmol。最佳反应程序为95 ° C，10 min ；95 ° C 15 sec, 58 ° C 1 min，45个循环，在每个循环退火、延伸阶段收集荧光信号。结果显示，禽类样品中均能特异性扩增103 bp大小的条带，Av-Bac标记的平均浓度为每克粪样中含6. 8士0本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种特异性指示禽粪便污染的基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：ａ）从水域中提取待测水样ＤＮＡ；ｂ）用荧光定量ＰＣＲ扩增样品ＤＮＡ；其中，引物核苷酸序列为：正向引物Ａｖ－ＢａｃＦ：　５’－　ＣＴＴＣＧＡＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＴ－３’反向引物Ａｖ－ＢａｃＲ：　５’－ＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＣＡＡＴＡ－３’探针序列为：ＦＡＭ－ＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＴＣＣ－ＴＡＭＲＡ；ｃ）将上述扩增产物核苷酸序列与下述核苷酸序列进行比对：Ａｖ－Ｂａｃ：５’－ＣＴＴＣＧ　ＡＴＧＧＡ　ＴＡＧＧＧ　ＧＴＴＣＴ　ＧＡＧＡＧ　ＧＡＡＧＧ　ＴＣＣＣＣ　ＣＡＣＡＴ　ＴＧＧＡＡ　ＣＴＧＡＧ　ＡＣＡＣＧ　ＧＴＣＣＡ　ＡＡＣＴＣ　ＣＴＡＣＧ　ＧＧＡＧＧ　ＣＡＧＣＡ　ＧＴＧＡＧ　ＧＡＡＴＡ　ＴＴＧＧＴ　ＣＡＡＴＧ　ＧＧＣＧ－３’若二者核苷酸序列相同，且该序列平均浓度为每毫升样品中含２．５±０．３　ｌｏｇ１０拷贝，则该水域判断为受禽粪便污染的水域。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：傅玲琳，王彦波，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：86