上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针制造技术

本发明专利技术上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针属于生物分子检测技术领域。为了克服现有QDs标记适配子的生物探针所存在的技术问题，包括导致靶分子所在生物体核酸的损伤，QDs的高背景信号、潜在毒性、“blinking”效应和化学不稳定性，提供一种上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针，包括由上转换纳米粒子作为荧光供体标记的适配子，和与适配子互补的DNA链，DNA链上连接有可与荧光供体发生FRET效应作为荧光受体的染料分子。本发明专利技术使用的荧光供体为UCNPs，其优点为低背景信号、无毒、无“blinking”效应并且化学稳定性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物分子检测
，具体地，本专利技术涉及上转换纳米粒子(UCNPs) 标记适配子的荧光生物探针。
技术介绍
适配子是一类特殊的核苷酸链，它针对多数靶分子具有高特异性和高亲合力，诸如有机染料分子、氨基酸、抗生素、蛋白，甚至整个细胞和微生物病原菌。适配子是通过在一个合成的随机序列寡核苷酸库中，以指数富集配基的系统进化过程方式经反复地洗脱、收集和再扩增而筛选制备出来。与传统抗体相比而言，适配子作为生物传感识别元件具有很多优异的特性。比如尺寸小、制备过程简单、保存期长、再生和化学修饰容易。其中最重要的是适配子能够折叠成多变的三级结构，通过氢键、范德华力和碱基堆积力的作用，以构象互补的方式与靶分子相互作用，这一过程的特点是借助靶分子构象变化，实现靶分子检测。 这一特点使得适配子生物探针的设计灵活和简便。目前，用来标记适配子作为荧光供体的物质主要分为两类荧光素类(如FAM， FITC)、罗丹明类(如TRITC，TAMRA)、花菁类(如Cy3，Cy5)等染料分子和半导体量子点。荧光素类(如FAM, FITC)、罗丹明类(如TRITC，TAMRA)及花菁类(如Cy3，Cy5) 等染料分子，作为荧光供体标记适配子形成的生物探针，是通过被标记的适配子与靶分子之间荧光各向异性的改变，来揭示适配子与靶分子之间的相互作用过程。但是，这类用于标记适配子的染料分子荧光性质极易受附近溶液环境以及其它分子的影响，导致荧光性质不稳定，会影响其检测灵敏度。另外，荧光染料分子的激发谱带窄、发射荧光谱带宽，并且荧光不稳定，这些缺陷使适配子生物探针在实际应用中在诸多方面受到了很大限制。后来人们使用半导体量子点(QDs)代替染料分子作为荧光供体，采用QDs标记适配子制备生物探针。所制备的生物探针其具体结构如下核心区域为QDs，QDs以亲和素和生物素连接适配子，适配子上连接有与之互补的DNA链，在DNA链上连接有可与QDs发生 FRET效应的染料分子作为荧光受体。但是，QDs在实际的生物应用中需要用紫外等短波长激发光激发，这种激发光会导致靶分子所在生物体核酸的损伤。而且，QDs还存在高背景信号、潜在毒性、“blinking”效应和化学不稳定性等不足。
技术实现思路
为了克服现有QDs标记适配子的生物探针所存在的技术问题，包括导致靶分子所在生物体核酸的损伤，QDs的高背景信号、潜在毒性、“blinking”效应和化学不稳定性，提供一种上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针。上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针，包括由荧光供体标记的适配子，和与适配子互补的DNA链，DNA链上连接有可与荧光供体发生FRET效应作为荧光受体的染料分子，其特征在于，由上转换纳米粒子作为荧光供体。本专利技术其效果在于，本专利技术所述的生物探针，由于标记适配子的UCNPs与染料分子靠的很近，满足FRET效应的距离要求。这时，在980nm光的激发下，UCNI^s与染料分子发生FRET效应，相应的荧光信号可以被检测到。当体系中加入序列可以与适配子序列互补的靶分子时，由于适配子结合靶分子的能力要强于与之互补的DNA链，互补的双链结构就会被破坏，连接染料分子的DNA链就会脱离适配子，染料分子也就远离了 UCNPs，这样FRET效应减弱，相应的荧光信号发生变化。本专利技术与现有QDs标记适配子的生物探针相比，具有如下优点(1)利用近红外光(980nm)激发得到535nm和650nm的上转换光，可避免高能量的激发光(紫光或蓝光)对被检测生物体核酸的损伤，同时也可避免生物体自荧光，这将会大大提高检测灵敏度和图像的清晰度。(2)本专利技术使用的荧光供体为UCNPs，其优点为低背景信号、无毒、无“blinking”效应并且化学稳定性强。(3)使用本专利技术上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针不需要昂贵的超短脉冲激光器。(4)采用UCNPs作为荧光供体，其发光具有光学稳定性强、发光谱线窄、发光能级寿命长等特点。(5)对于荧光信号的分析检测时间短和不需要昂贵的分辨仪器。(6)和QDs相比，UCNPs具有高的稳定性，在激发的情况下不产生单态氧成分，不会造成被检测生物样本的损伤。附图说明图1为现有技术中QDs标记适配子生物探针的示意图；图2为本专利技术上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针的结构示意图；图3为本专利技术上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针对ATP的检测效果图。具体实施例方式具体实施方式一结合图2说明本实施方式，上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针，包括由荧光供体标记的适配子，和与适配子互补的DNA链，DNA链上连接有可与荧光供体发生FRET效应作为荧光受体的染料分子，由UCNPs作为荧光供体，本实施方式所述 UCNPs 为 NaYF4 Yb，Er、NaYF4 Yb，Tm、NaYF4 Yb，Ho、LaF3 Yb，Er、LaF3 Yb，Tm 或 LaF3 Yb， Ho中的一种，本实施方式所述的UCNPs是水溶性的，本实施方式所述的UCNPs与适配子以亲和素和生物素连接。具体实施方式二 结合图2和图3说明本实施方式，本实施方式为具体实施方式一所述的上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针的制备方法(1)制备 UCNPs 将 0. 272 克 CF3COONa, 0. 376 克 Y (CF3COO) 3，0. 113 克 Yb(CF3COO)3 和0. 055g克Er (CF3COO)3溶解于IOml的油胺中，置入三颈瓶中，在氩气保护下，100°C搅拌 30分钟，逐步升温至320°C并保持1小时。产物离心分离，并用环己烷超声洗涤，得到UCNPs 的环己烷溶液。(2)利用氨基磷酸对步骤(1)制备出的UCNPs进行水相转移称取0. 13克氨基磷酸分散于5ml乙醇中，向其中滴加:3mlUCNPs的环己烷溶液，室温搅拌M小时，产物用乙醇4离心洗涤，并分散于PBS溶液，得到UCNPs晶体分散于PBS的胶体溶液。(3)将亲合素加入到步骤(2)所得到的产物中，生成连有亲和素的UCNPs 取2mL 步骤(2)所得到的胶体溶液，并加入终浓度为5%的戊二醛，搅拌反应12小时；对产物离心清洗三次除掉过量的戊二醛后，重新分散于PBS缓冲液中。(4)将连有生物素的适配子与连有亲和素的UCNI^s偶联，生成由UCNI^s标记的适配子在步骤(3)得到的产物中加入Img亲合素分子，在4°C下继续振荡反应48小时；将生成物离心纯化，4°C保存于测试信号缓冲液(pH 8. 2,20mM Tris_HCl，5mM KCl，lmM MgCl2)中。(5)向由步骤⑷得到的产物中加入由染料分子标记的与适配子互补的DNA链，生成UCWs标记适配子的生物探针步骤(4)得到的产物中加入由染料分子标记的与适配子互补的DNA链，如表1所示，表1为构建UCNPs标记适配子的荧光探针所用的DNA序列，在信号缓冲液中先振荡加热至70°C，保持3min，然后再将溶液缓慢的降至室温，得产物。表本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针，包括由荧光供体标记的适配子，和与适配子互补的ＤＮＡ链，ＤＮＡ链上连接有可与荧光供体发生ＦＲＥＴ效应的染料分子作为荧光受体，其特征在于，由上转换纳米粒子作为荧光供体。

【技术特征摘要】
1.上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针，包括由荧光供体标记的适配子，和与适配子互补的DNA链，DNA链上连接有可与荧光供体发生FRET效应的染料分子作为荧光受体，其特征在于，由上转换纳米粒子作为荧光供体。2.根据权利要求1所述的上转换纳米粒子标记适配子的荧光生物探针，其特征在于， 所述的上转换纳米粒子是水溶性的。3.根据权利要求1所述的上转换...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓敏，孔祥贵，涂浪平，张友林，曾庆辉，
申请(专利权)人：中国科学院长春光学精密机械与物理研究所，
类型：发明
国别省市：82