一种牡丹芍药远缘杂交后代的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种植物杂种后代鉴定方法，特别是涉及一种牡丹芍药远缘杂交后代的鉴定方法。本发明专利技术提供鉴定方法包括：杂种苗早期形态鉴定筛选，叶绿体DNA鉴定母本，SSR分子标记鉴定父本。通过形态和分子相结合的方式，对杂交后代进行鉴定，鉴别真假杂种，研究总结真正杂种苗与父母本的关系，确定可遗传的外界形态指标，于分子遗传层面，得出合理的杂交种与亲本应有的遗传距离，亲缘关系的远近程度，最终在形态和分子遗传两个层面上相结合建立合理的鉴定标准体系，使后期的选育过程可以有效进行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物杂种后代鉴定方法，特别是涉及。
技术介绍
芍药属包括大约35个种，目前被划分为三个组，即牡丹组(sect. Moutan DC)、芍药组(sect. Paeonia)和北美芍药组(sect. Onaepia Lindl)。“花王”牡丹与“花相”芍药是中国栽培历史悠久的传统名花，素有“花中二绝”的美誉，其美丽历来都被人们所推崇。由于二者在叶型、花型、花期及生长习性等特征方面差异较大，所以它们虽然都是芍药科芍药属植物，但木本的牡丹属于牡丹组，草本的芍药属于芍药组。历史上在相当长的一段时间内人们普遍认为这两组植物问的杂交是“不可能的”，但是随着育种技术的发展，这种“不可能” 变成了现实，一支与牡丹芍药竞相媲美的奇葩——Itoh杂种出现了。组间远缘杂交，授粉后容易获得种子并萌发成单株，大量的杂交后代为杂交育种工作的优株选择以及后期管理增加了难度，故而需要尽快建立一套合理简便的杂种早期鉴定体系，对杂交后代进行鉴定，鉴别真假杂种，研究总结真正杂种苗与父母本的关系，确定可遗传的外界形态指标，于分子遗传层面，得出合理的杂交种与亲本应有的遗传距离，亲缘关系的远近程度，在形态和分子遗传两个层面上相结合建立合理的鉴定标准体系，对于符合该要求的则暂且保留，继续观察待选，否则直接淘汰，使后期的选育过程可以有效进行， 以免浪费人力、物力和财力，这是在芍药属育种过程中必须重视的工作。目前在园林植物远缘杂交育种过程中所用的杂种鉴定手段主要有形态学标记鉴定法、抱粉学研究鉴定法、细胞学标记鉴定法、生化标记鉴定法和分子标记鉴定法。为了鉴定结果的可靠性，一般不能单一的选择一种方法进行鉴定，而是两种或者多种方法同时使用。以形态学标记为主，辅助使用其他标记方法。而对于有关芍药属远缘杂交后代的鉴定工作，国内鲜有研究，目前仅报道有张栋、 郝青、关坤等进行了这方面的工作。张栋等Q008)利用AFLP技术对紫斑牡丹7个无性系与‘正午’杂交产生的22个子代进行了鉴定，对特异性条带的分析结果表明，在远缘杂交的Fl代个体中出现母本特异性条带的几率多于父本，多数杂种与母本亲缘关系相对于父本近；通过杂交组合遗传相似系数计算和UPGMA聚类分析也得出了杂交后代为偏母本融合型杂种的结论。郝青等Q008)在北京昌平首次发现一芍药和牡丹的远缘杂交种，将该杂交种命名为‘和谐’。这是国内第一株开花的‘伊藤杂种’，通过对其进行形态性状观察和SRAP分子标记，充分证明了 ‘和谐’为组间杂交种。关坤Q009)对以牡丹肉质花盘亚组牡丹为母本和革质花盘亚组牡丹为父本进行亚组间的远缘杂交所得的杂交后代共158株进行形态方面以及RAPD分子标记方面的研究。 结果表明，RAPD技术可以进行有效的亚组间远缘杂交后代的真假杂种鉴定，但对于以后进一步的真杂种品种间的亲缘关系聚类鉴定，则可能需要更为进一步的研究。国内对组间杂种亲缘关系的研究不多，究其原因，主要一方面是因为国内的组间杂种资源不多，众所周知，组间杂种起源于日本，发展于美国，价格昂贵且稀缺，因此造成了国内这方面的科研材料缺乏。而关于杂种鉴定方面的工作研究不多，则可能是因为目前远缘杂交还面临着许多问题如亲本的杂交不亲和性，授粉后不育性，杂交时间太长，亲本花期不遇，亲本间亲缘关系不明确，杂种萌发率低，或者可以萌发但Fl代可育性低等。受这些客观条件的影响，限制了我国在芍药属组间杂种这个芍药属育种界的奇迹方面的研究工作。随着远缘杂交种新品种的不断出现和育种工作的不断进步，近年来，越来越多的组间杂种被引入国内，国内的不少科研机构通过持续的努力，在远缘杂交育种方面也有了新的进展。加上目前的DNA测序、分子标记等分子生物学手段都已逐渐应用到芍药属各方面的研究，对芍药属组间杂种亲缘关系的研究只会越来越深入和全面，而建立一套高效的组间杂种早期分子鉴定技术路线也是势在必行。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供。本专利技术提供的牡丹芍药远缘杂交后代的鉴定方法，包括如下步骤1)对杂交亲本和杂种后代进行形态指标初步筛选；2)对步骤1)筛选出的杂种后代和父母本分别进行叶绿体基因测序；3)对步骤1)筛选出的杂种后代和父母本分别进行SSR分子标记。其中，步骤1)还包括将测定的形态指标中的非数值类性状进行编码处理，对多元性状按无序性状处理，计算与父母本的遗传距离。其中，步骤2~)还包括对获得的叶绿体基因进行系统发育分析，鉴定杂交后代的母本。优选将多个叶绿体基因进行合并分析其中，步骤幻还包括将扩增获得的SSR标记进行测序，计算等位基因数及等位基因频率，鉴定杂交后代的父本。所述的叶绿体基因优选为petB-petD、rpsl6-trnQ或它们的特异性片段。优选用 CTATCGTCCRACCGTTACWGAGGCT(SEQ ID No. 1)和 CAAAYGGATAYGCAGGTTCACC(SEQ ID No. 2)扩增出的 petB-petD 基因片段，用 CGTTGCTTTCTACCACATCG (SEQ ID No. 3)和 TTACTCGGAGGTTCGAATCC(SEQ ID No. 4)扩增出 rpsl6_trnQ 基因片段。所述的SSR 标记优选为 Pdel02-2、Pdel05、Pdel07、Pdel20、Pdel22、Pdel29b、 Pdel33、Pdel35、Jx02-2 和 Jxl7 中的一种或多种。通过形态和分子相结合的方式，对杂交后代进行鉴定，鉴别真假杂种，研究总结真正杂种苗与父母本的关系，确定可遗传的外界形态指标，于分子遗传层面，得出合理的杂交种与亲本应有的遗传距离，亲缘关系的远近程度，最终在形态和分子遗传两个层面上相结合建立合理的鉴定标准体系，使后期的选育过程可以有效进行。附图说明图1所示为2个亲本和杂种后代的叶片。其中，A为杂种；B为父本；C为母本。图2所示为2个亲本和11个未开花杂种后代表型性状的主坐标分析图。图3所示为2个亲本和4个开花杂种后代表型性状的主坐标分析图。图4所示为基于两个叶绿体基因片段的21个杂交后代与2个亲本的UMPGA进化树。图5所示为亲本和子代共享等位基因的分布图。其中，Ν-Η、Ν-Ρ4Π N-M分别表示杂种、父本和母本的专有等位基因；N-PH和N-MH分别表示父本和杂种共享的等位基因和母本和杂种共享的等位基因。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1杂种苗选择和形态性状调查杂种苗获得方法将父本花蕾在露色期采回，在室内摘下花药，放在干燥、无阳光直射的条件下阴干Mh。轻拍花药至花粉完全散出，用筛子分离花粉与花药，将筛出的花粉收集于干净的小瓶中，贴上标签放置于-20°C的冰箱中贮藏备用。选择生长健壮的植株作为母本，在母本花蕾风铃期或露色期用镊子或徒手将花瓣和雄蕊掐掉或撕掉，用硫酸纸套袋套在花头上并用回形针将袋口轧紧。母本套袋3-4天后，柱头开始分泌粘液时开始授粉。授粉于11点前或17点后进行，连续重复三天，共授三次。当年8、9月底，当母本变为心皮蟹黄色且微裂时摘下，采收后播种于苗床，播种后定期浇水，保持土壤湿润。定期浇水、松土、 拔草与喷药。从2003-2007年，根据上述的方法进行牡丹和芍药的远缘杂交，母本为 P. Iactiflora ‘粉云飞本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种牡丹芍药远缘杂交后代的鉴定方法，其包括如下步骤：１）对杂交亲本和杂种后代进行形态指标测定，初步筛选杂种后代；２）对步骤１）筛选出的杂种后代和亲本分别进行叶绿体基因测序；３）对步骤１）筛选出的杂种后代和亲本分别进行ＳＳＲ分子标记的扩增。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：成仿云，张娜娜，袁军辉，韩丽晓，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：11