一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测农药残留的免疫层析试纸及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测农药残留的免疫层析试纸及其制备方法，属于化学鉴定技术领域领域。本发明专利技术的农药试纸包含试纸板、样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元；样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元均连接于所述试纸板上；所述检测单元位于所述试纸板的中间；所述检测单元包含抗原包被液以及封闭液。本发明专利技术的有益效果为：试纸具有“快速、简便、特异、敏感、低成本”的特点，特别是其“快速、简便”的特点，特别适合于广大基层单位、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等，显示巨大的发展潜力和应用前景，被认为是食品安全检测最有前途的新技术之一，已成为食品安全检测的主要发展趋势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学鉴定
，特别是一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测农药残留的免疫层析试纸及其制备方法。
技术介绍
在20世纪80年代初，在西方发达国家兴起了一种快速检测的技术，其原理是通过胶体金结合垫、纳米材料结合垫、量子点结合垫、荧光素结合垫等的毛细管作用，用与结合垫相对应的材料进行标记，经过硝酸纤维素膜作用，抗体和抗原在此特异性结合，将此技术称为免疫层析试纸检测技术。用于标记的这些物质都具有肉眼可见或在紫外光激发下看出抗体与抗原特异性结合的颜色或荧光显现。免疫层析试纸条因其快速、简便及操作简单等特点，其使用领域也越来越广，且得到了很好的发展。用于试纸条标记的材料也越来越多。免疫层析试纸主要组成部分为样品垫、标记物结合垫、硝酸纤维素(Nitrocellulose，NC)膜、T线(检测线)、C线(质控线)、吸水垫、聚氯乙烯(Polyvinlchloride，PVC)底板。如胶体金试纸，由于胶体金的特点，试纸制备原理分为竞争法和夹心法。竞争法：当联有待测抗原的样品滴加到样品垫上时，通过毛细管作用，样品向前移动，到胶体金结合垫上时，样品中的抗原会与抗体特异性结合。到达T线时，T线上的抗体会与样品中剩余的抗体特异性结合，变红。样品再继续移动，到达C线时，再次与C线上的抗体反应，变红。当试纸条上出现两条红线时，说明样品中的抗原含量低于检测线，呈阴性。反之，当样品中的抗原含量高于检测限时，在胶体金结合垫上抗原大部分与抗体特异性结合，T线未出现红色，而C线出线红色，则为阳性。无论样品中的待测抗原高于还是低于检测线，C线都应出现，否则试纸条无效。与之实验结果相反，出现两条红线为阳性，一条红线为阴性的方法为夹心法。农药残留问题是随着农药大量生产和广泛使用而产生的。到目前为止，世界上化学农药年产量近200万吨，约有1000多种人工合成化合物被用作杀虫剂、杀菌剂、杀藻剂、除虫剂、落叶剂等类农药。农药尤其是有机农药大量施用，造成严重的农药污染问题，成为对人体健康的严重威胁。免疫试纸技术在医学、兽医诊断，农业，生物福利，食品安全，环境安全，工业检测，甚至新出现的分子诊断及纳米治疗领域都有广泛的应用，具有非常广泛的应用前景。在食品安全检测领域里，主要涉及到兽药、农药残留，违禁添加物、生物毒素、重金属、环境毒素等，基本上大多数的食品安全检测涉及的都可以应用到。技术上来说，免疫试纸检测技术具有“快速、简便、特异、敏感、低成本”的特点，特别是其“快速、简便”的特点，适用于现场巨量样品检测，有着巨大的应用前景，被认为是食品安全检测最有前途的新技术之一，已成为食品安全检测的主要发展趋势。目前农药残留分析主要采用仪器分析和免疫分析方法。我们国家用的最多的，按照试验数来算的话，就是试纸。其他的技术当然都在用，但是试验的绝对数都没有试纸多，气-质色谱、液-质色谱难以应付巨量的样品。其中仪器分析法具有灵敏度、准确度高和精密度好等优点，但存在样品前处理繁琐、试剂用量大、费时、分析成本高，需昂贵的仪器设备等缺点，不适合现场快速检测。纳米生物技术是纳米技术与生物技术交叉渗透形成的新技术，利用纳米生物技术对细胞内外物质分析和检测、疾病早期诊断、生物分子的示踪标记等研究一直是国内外相关领域的研究重点。为了能实现食品及环境中农药残留的快速检测，科学工作者开始关注上转换(将长波长光转换为短波长光发射的过程)纳米荧光材料。上转换纳米荧光材料是一类用980nm红外光做激发光源的材料，用此激发光做激发源的材料光穿透度较深，在生物组织内不会发光，故不产生背景荧光，对生物组织的损伤几乎为零。合成该类材料的物质毒性较小，且具有良好的化学稳定性，发光强度较好，它的吸收和发射带窄，从而降低检测背景，提高信噪比，这些特征导致上转换纳米荧光材料拥有非常好的生物应用前景。建立起基于上转换纳米材料快检农药多(单)残留的方法无疑是非常重要的，到目前为止，上转换纳米荧光材料已在细胞标记、生物大分子检测、小动物成像、光动力学疗法及药物输送等方面得到了应用。但将上转换纳米荧光材料用作标记物，与免疫层析技术相结合进行小分子农药残留的分析还未见报道。利用上转换纳米材料快速检测农药多(单)残留的分析方法，对发展快检农药多残留检测技术具有重要的理论研究和实际应用意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，制作出纳米级上转换发光材料。本专利技术提供快速检测农药残留的免疫层析试纸，所述试纸包含：试纸板、样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元；样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元依次相连且均连接于所述试纸板上；所述样品滴加单元与样品回收单元位于所述试纸板的两端，所述检测单元位于所述试纸板的中间；所述检测单元包含纳米粒子标记结合垫、检测线和质控线；所述检测线位于所述纳米粒子标记结合垫和所述质控线之间；所述纳米粒子标记结合垫包含抗原包被液以及上转换荧光纳米粒子标记抗体试样；所述上转换荧光纳米粒子标记抗体试样为β-NaYF4:Yb3+/Er3+标记2,4-D-IgG的PBS溶液。优选地，所述检测线以及质控线均位于层析膜上，纳米粒子标记结合垫与所述层析膜相连；所述层析膜为NC硝酸纤维素膜。优选地，所述纳米粒子标记抗体试样中β-NaYF4:Yb3+/Er3+标记2,4-D-IgG的含量为0.00666-0.132μg/mL。优选地，所述检测线上的标记物为2,4-D-OVA，所述质控线的标记物为羊抗兔二抗。本专利技术还保护检测农药残留试纸的制备方法，包含下列步骤：S1.制备水溶性稀土上转换纳米材料；S2.制备农药多克隆抗体以及检测所述农药多克隆抗体的效价；S3.利用所述步骤S1制备的产物标记所述农药多克隆抗体；S4.利用所述步骤S3产物制备检测农药残留试纸。优选地，所述步骤S1包含：S1.1将稀土氯化物、油酸以及十八烯置于烧瓶中搅拌抽真空30min，后停止搅拌加热；S1.2将NaOH、NH4HF2以及甲醇置于烧杯中放入搅拌子，封上封口膜，于磁力搅拌器上常温搅拌；S1.3将所述步骤S1.1产物加热到150℃，保温15～20min即可，随即关闭搅拌，关闭加热，使之降低至室温；S1.4尽量少进空气的情况下滴加S1.2溶液，反应完全后通入N2，将滴加过程中进入的空气排尽；S1.5将体系加热至75-85℃，保温1.5h；S1.6在0.5h内将所述步骤S1.5的产物升温至310℃，N2保护下保温2h，随即在N2保护及搅拌下冷却至室温；S1.7洗涤产物；S1.8利用所述步骤S1.7产物制备水溶性β-NaYF4:Yb3+,Er3+纳米粒子。优选地，所述步骤S1.8包含：S1.8.1将所述步骤S1.7的产物、环己烷、叔丁醇、去离子水以及K2CO3溶液室温下混合搅拌；S1.8.2将KMnO4和NaIO4水溶液缓慢滴入所述步骤S1.8.1的产物，40℃下反应48h，用95％乙醇洗涤离心得初产物；S1.8.3初产物溶于HCl中，常温下搅拌反应，反应结束后离心洗涤离心得到产物。优选地，所述步骤S3包含：S3.1分别配置pH＝5以及pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液；S3.2制备水溶性β-NaYF4:Yb,Er标记2,4-D-IgG。优选地，所述步骤S3.2为：S3.2.1取经KMnO4-NaIO4氧化溶于水的β-NaY本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测农药残留试纸，其特征在于所述试纸包含：试纸板、样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元；样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元依次相连且均连接于所述试纸板上；所述样品滴加单元与样品回收单元位于所述试纸板的两端，所述检测单元位于所述试纸板的中间；所述检测单元包含纳米粒子标记结合垫、检测线和质控线；所述检测线位于所述纳米粒子标记结合垫和所述质控线之间；所述纳米粒子标记结合垫包含抗原包被液以及上转换荧光纳米粒子标记抗体试样；所述上转换荧光纳米粒子标记抗体试样为β‑NaYF4:Yb3+/Er3+标记2,4‑D‑IgG的PBS溶液。

【技术特征摘要】
1.检测农药残留试纸，其特征在于所述试纸包含：试纸板、样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元；样品滴加单元、检测单元以及样品回收单元依次相连且均连接于所述试纸板上；所述样品滴加单元与样品回收单元位于所述试纸板的两端，所述检测单元位于所述试纸板的中间；所述检测单元包含纳米粒子标记结合垫、检测线和质控线；所述检测线位于所述纳米粒子标记结合垫和所述质控线之间；所述纳米粒子标记结合垫包含抗原包被液以及上转换荧光纳米粒子标记抗体试样；所述上转换荧光纳米粒子标记抗体试样为β-NaYF4:Yb3+/Er3+标记2,4-D-IgG的PBS溶液。2.根据权利要求1所述的检测农药残留试纸，其特征在于，所述检测线以及质控线均位于层析膜上，纳米粒子标记结合垫与所述层析膜相连；所述层析膜为NC硝酸纤维素膜。3.根据权利要求1所述的检测农药残留试纸，其特征在于，所述纳米粒子标记抗体试样中β-NaYF4:Yb3+/Er3+标记2,4-D-IgG的含量为0.00666-0.132μg。4.根据权利要求1所述的检测农药残留试纸，其特征在于，所述检测线上的标记物为2,4-D-OVA，所述质控线的标记物为羊抗兔二抗。5.检测农药残留试纸的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：S1.制备稀土上转换纳米材料；S2.制备农药多克隆抗体以及检测所述农药多克隆抗体的效价；S3.利用所述步骤S1制备的产物标记所述农药多克隆抗体；S4.利用所述步骤S3产物制备检测农药残留试纸。6.根据权利要求5所述的检测农药残留试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包含：S1.1将稀土氯化物、油酸以及十八烯置于烧瓶中搅拌抽真空30min，后停止搅拌加热；S1.2将NaOH、NH4HF2以及甲醇置于烧杯中放入搅拌子，封上封口膜，于磁力搅拌器上常温搅拌；S1....

【专利技术属性】
技术研发人员：华瑞年，国婷婷，张伟，于基成，那立艳，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21