一种针对HBV S-表面抗原的单克隆抗体可变区及编码它的基因制造技术

提供了一种针对乙型肝炎病毒Ｓ－表面抗原的单克隆抗体的可变区和编码它的基因，包含该基因的重组载体，和获自该重组载体的转化子。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

该专利技术涉及一种针对乙型肝炎病毒S-表面抗原的单克隆抗体可变区和编码它的基因，一种包含该基因的重组载体，和一种获自该重组载体的转化子。
技术介绍
乙型肝炎病毒(自此以后，称为“HBV”)，也称为丹氏粒，具有42nm直径的球形特征。外包被包含大量的乙型肝炎表面抗原，并将由180种乙型肝炎核心蛋白组成的核壳包裹在内。核壳包含HBV基因组，聚合酶等(Summers等.，Proc.Nat.Acad.Sci，72，4579，1975；Pierre Tiollais等.，Science，213，406-411，1981)。在HBV基因组内，HBV表面抗原的编码区包含三个开放阅读框起始位点，其共用一个产生同样的S结构域的终止密码子。因此，HBV表面抗原可分为三种类型即，(1)小HBV表面抗原(自此以后，称为“S-表面抗原”)，其仅包含S结构域，(2)中等HBV表面抗原(自此以后，称为“M-表面抗原”)，其包含S结构域和附加的已知为Pre-S2的55个氨基酸的结构域，和(3)大HBV表面抗原(自此以后，称为“L-表面抗原”)，其包含Pre-S1结构域以及Pre-S2和S结构域。在表达的表面抗原中，S-表面抗原约占80％，或者更多。根据其抗体识别特性，S表面抗原被分成亚类。在所有表面抗原中表达的抗原性结构域被分为决定簇a。四种其它亚类为d或y和w或r。决定簇d的122位残基是赖氨酸，而y是精氨酸。类似地，决定簇w的160位残基是赖氨酸，而r是精氨酸(Kennedy R.C.等.，J.Immunol.130，385，1983)。因此，血清型可被分为四种亚型，如adr，adw，ayr和ayw(Peterson等.，J.Biol.Chem.257，10414，1982；Lars O.Marnius等.，intervirology，38，24-34，1995)。S-表面抗原特异结合于肝细胞(Leenders等.，Hepatology，12，141，1990；Irina Ionescu-Matiu等.，J.Med.Virology，6，175-178，1980；Swan N.T.等.，Gastroenterolgy 80，260-264，1981；Swan N.T.等.，Gastroenterolgy 85，466-468，1983；Marie L.M.等.，Proc.Nat.Acad.Sci.81，7708-7712，1984)。并且，已经鉴定了人肝质膜含有与S-表面抗原特异结合的靶蛋白，如载脂蛋白H和内联蛋白II(Mehdi H.等.，J.Viro.，68，2415，1994；HertogsK.等.，Virology，197，265，1993)。同时，在开发有用的治疗性单克隆抗体时，由于在将来源于小鼠的单克隆抗体应用于人体时，能够引起免疫反应，所以优选人源化的抗体。最近，韩国专利出版物第1999-8650公开了一种针对Pre-S1表位的单克隆抗体的可变区，所述表位仅存在于三种HBV表面抗原(S-，M-，和L-表面抗原)中的L-表面抗原，编码它的基因，和一种使用它的人源化抗体。然而，由于L-表面抗原仅占表达的表面抗原的1-2％，所以L-表面抗原不适合作为用于诊断和治疗目的的抗HBV抗体开发的靶目标。
技术实现思路
因此，本专利技术的主要目的是提供一种编码单克隆抗体可变区的基因，所述单克隆抗体特异识别S-表面抗原，尤其是决定簇a，该决定簇通常存在于所有的HBV表面抗原中。本专利技术的另一个目的是提供一种含有上述基因的重组载体。本专利技术的另一个目的是提供一种使用上述重组载体获得的转化子。本专利技术的另一个目的是提供一种上述单克隆抗体的可变区。与本专利技术的一个方面一致，提供了一种编码特异识别HBV S-表面抗原的单克隆抗体可变区的基因。本专利技术人使用在韩国HBV患者中最为流行的决定簇adr的S-表面抗原(International Ezymes Inc.，USA)免疫小鼠。从免疫小鼠获得的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2O-Ag14，ATCC CRL-1581)融合产生了大量杂交瘤细胞，接着随后的克隆和筛选程序，最终产生了许多单克隆抗体。本专利技术人从许多的单克隆抗体中筛选了特异结合于决定簇a的单克隆抗体；结果，获得一株产生独特单克隆抗体的杂交瘤细胞系(mC6-9-1)，所述单克隆抗体以高的结合亲和力特异结合于决定簇a。本专利技术人从所述杂交瘤细胞系分离了的总RNA，用以合成轻链和重链的cDNA，最后，分别获得了包含SEQ ID NO.5的约440bp轻链cDNA基因和包含SEQ ID NO.6的约480bp重链cDNA基因。从所述单克隆抗体轻链和重链，检测了CDR(互补决定区)残基。结果，鉴定了轻链CDR残基在分别代表SEQ ID Nos.9，10和11的肽的24-40，56-62，和95-102位置存在。而且，发现重链CDR残基在分别代表SEQ ID Nos.12，13和14的肽的31-35，50-66和99-111的位置存在。因此，在本专利技术的范围内，包括一段cDNA，其编码抗HBV S-表面抗原的单克隆抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID Nos.9，10和11的肽。此外，本专利技术包含一段cDNA，其中轻链可变区具有SEQ IDNO.7的氨基酸序列，优选地，包含SEQ ID NO.5的核苷酸序列的cDNA。在本专利技术的范围内，还包括一段cDNA，其编码抗HBV S-表面抗原的单克隆抗体的重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID Nos.12，13和14的肽。此外，本专利技术包含一段cDNA，其中所述重链可变区具有SEQ IDNO.8的氨基酸序列，优选地，包含SEQ ID NO.6的核苷酸序列的cDNA。上述编码单克隆抗体轻链或重链可变区的cDNA基因可以被插入到质粒载体中，例如pCRII(Invitrogen Co.USA)，以制备重组载体。因此，在本专利技术的范围内，还包括一种重组载体pCRC6Lv，其包含上述编码轻链可变区的cDNA，和包含上述编码重链可变区的cDNA的重组载体pCRC6Hv。此外，用上述重组载体，pCRC6Lv和/或pCRC6Hv转化微生物，如大肠杆菌，以获得转化子。因此，本专利技术包含转化子大肠杆菌DH5α/pCRC6Lv(KCTC，10239BP)，和转化子大肠杆菌DH5α/pCRC6Hv(KCTC，10238BP)，它们分别用重组载体pCRC6Lv和pCRC6Hv转化。利用已知的方法(J.Sambrook等.，Molecular Cloning，卷1，1.25-1.28)从上述转化子中重新获得重组载体。例如，用溶液1(50mM葡萄糖，25mMTris·HCl，和10mM EDTA)将转化子细胞膜弱化。用溶液2(0.2N NaOH和1％SDS)破坏细胞膜，并使蛋白和染色体变性。用溶液3(5M醋酸钾和醋酸)聚集除重组载体以外的成分，然后离心。可用乙醇沉淀获得的重组载体层以重新获得重组载体。在本专利技术的范围内，包括一种单克隆抗体可变区，其由含有SEQ IDNos.9，10和11的肽的轻链和含有SEQ ID Nos.12，13和14的肽的重链组成。而且，优选的是单克隆抗体可变区，其中轻链可变区具有SEQ IDNO.7的氨基酸序列，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码针对乙型肝炎病毒Ｓ－表面抗原的单克隆抗体轻链可变区的ｃＤＮＡ，所述轻链可变区包含ＳＥＱＩＤＮｏｓ．９，１０和１１的肽。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李钟郁，高仁泳，康熙根，宋武泳，宋泰勋，金昶硕，
申请(专利权)人：株式会社柳韩洋行，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]