一种建立昆虫细胞系的方法技术

本发明专利技术涉及建立昆虫细胞系的方法，包括：将昆虫浸没在乙醇溶液中，用无菌蒸馏水清洗昆虫，吸干虫体表面；解剖昆虫，取出需要建立细胞系的完整昆虫组织或器官；分别用生理盐水和细胞培养液清洗昆虫组织或器官，放入无光照的细胞培养箱中培养；加入细胞培养液培养；并不断吸出和换入半量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，加入新的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养至细胞系建立初步成功。该方法将能在短期内快速、可重复地建立多种昆虫的细胞系，所需的昆虫细胞培养设备简单，可操作性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种建立细胞系的方法，尤其涉及。
技术介绍
培养昆虫细胞作为研究材料，一直是细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要方面，而且在昆虫杆状病毒表达载体技术日益完善并大规模付诸商品化应用的当今，昆虫细胞作为这种表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的经济意义或科学意义非常重大的外源蛋白质；同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂，昆虫细胞也发挥了重要的作用。据报道，目前已经建立的昆虫细胞系超过400多种，对于每一株细胞系，无论是来自同一种昆虫甚至同一个体、同一器官组织，在细胞系的建立和细胞的培养过程中，都会出现不同程度的变异，其细胞生物学特性、对特定杆状病毒的感受性等都有可能不同。因而科学家们根据研究的需要或某些商业目的，会尝试从不同种昆虫、同一种昆虫不同器官组织中，建立和筛选各种类型的细胞系，以满足不同的需求。传统的昆虫细胞系的建立方法带有很大的随机性和不确定性，多将相应的昆虫器官或组织剪碎，或用胰蛋白酶把昆虫组织消化，释放出单个或成团的细胞，放入特定的细胞培养液中培养，并定时更换细胞培养液。细胞系建立成功与否随机性很强，有很大的不确定性，多数情况下以失败告终，而且这个过程很长。一般一个细胞系建立成功多需要1.5-2年的时间，有些耗时更长。因此，目前已有的400多株细胞系是在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，无数实验室不懈努力的成果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够快速、有效、可重复地建立昆虫细胞系的方法，这种方法可以在短期内建立需要研究或生产用的昆虫细胞系，能够提供大量的昆虫细胞种类的来源，并供使用者筛选，使建立细胞系成为实验室的常规实验方法成为可能。本专利技术所提供的建立昆虫细胞系的方法包括如下步骤(1)将实验昆虫浸没在乙醇溶液中10-60分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干虫体表面；(2)解剖昆虫，取出需要建立细胞系的完整昆虫组织或器官；(3)用生理盐水清洗(2)中获得的组织或器官2-3次，再用细胞培养液清洗，清洗后把该组织或器官放入细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入25-29℃无光照的细胞培养箱中培养4-24小时；(4)加入适量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，在与步骤(3)同样条件下培养；(5)每5-7天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；(6)把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多新的细胞培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立初步成功；整个过程都是在无菌条件下进行的。本专利技术方法所使用细胞培养液的说明本专利技术所使用的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和动物血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6.0-6.8之间。其中该昆虫细胞培养液可以选用目前已经商品化的昆虫细胞培养液，例如TNM-FH，SF900，TC-100，Grace’s四种中的任何一种，优选TNM-FH；青霉素含量为50-100U/mL，优选100U/mL；链霉素含量为50-100U/mL，优选100U/mL；动物血清可以选用小马血清，胎马血清，小牛血清和胎牛血清中的任何一种，优选胎牛血清；动物血清含量为细胞培养液的5-20％(体积比)，优选10％。相对于传统的细胞系建立方法，这个过程由通常的耗时1.5-2年缩减到1-3个月，其优势非常明显，而且本专利技术方法的重复性很强，用同样方法建立同样昆虫组织的细胞系，在预定的时间内可以使细胞传代，因而大大提高了昆虫细胞系建立的效率。第一次传代以后，根据细胞生长增殖的情况，用传统培养昆虫细胞系的方法对细胞进行分瓶传代处理。根据不同细胞系的特性，细胞系的生长将在第一次传代1-3个月后达到稳定状态。此时可以定期传代，并用传统细胞冻存的方法对一定代次的部分细胞进行冻存处理，保存细胞的种资，其它细胞用于常规的细胞生物学特性鉴定，并进行相应的科学实验和生产应用。具体实施例方式实施例1在无菌操作台内(以下操作都在无菌条件下，所使用器具都要经过灭菌或消毒处理)将5龄的光肩星天牛Anoplophora glabripennis幼虫一头浸没在70％的乙醇溶液中20分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗天牛幼虫，吸水纸吸干虫体表面。解剖该昆虫，取出脂肪体组织，操作时尽量保持其完整，注意不能触破昆虫的消化道等同体外直接相连的部分。用生理盐水清洗该组织2-3次，再用细胞培养液(以TNM-FH为主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的链霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.2)清洗一次，清洗后直接用尖嘴镊把该组织放入25cm2的细胞培养瓶中，在此过程中连带少量的上述细胞培养液同组织块一同放入培养瓶，盖紧瓶盖。这时脂肪体组织块的底面直接接触培养瓶底，并使保持这种状态，放入摄氏27℃无光照的细胞培养箱中培养10小时。然后加入3mL上述细胞培养液，使脂肪体组织块大部分浸没在细胞培养液中，放入同样条件下培养，注意该方法成功建立细胞系的关键是要使组织块紧贴在细胞培养瓶底，勿使组织块悬浮在细胞培养液中。以后每7天左右吸出半量的培养液，并同时换入半量的新培养液。在此操作第7天后可以观察到组织块在离体并在上述培养条件下，很快从其周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展。第28天后见到细胞不断增殖并充满整个培养瓶，把含有新增殖出的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入2mL新的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多新的细胞培养液。两个培养瓶放入培养箱中培养，标志着细胞开始传代，光肩星天牛幼虫脂肪体细胞系建立初步成功。在细胞开始传代的第7天后开始第二次分瓶传代，以后传代时间逐渐缩短，传到第8代时，细胞生长开始稳定，在27℃下，每3天就要传代一次，最终该细胞系被命名为Angl II。实施例2在无菌操作台内(以下操作都在无菌条件下，所使用器具都要经过灭菌或消毒处理)将3日龄的甜菜夜蛾Spodoptera exigua雌虫的蛹一头浸没在70％的乙醇溶液中40分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗该蛹，吸水纸吸干蛹体表面。解剖取出该蛹的卵巢，操作时尽量保持其完整，注意不能触破昆虫的消化道等同体外直接相连的部分。用生理盐水清洗卵巢3次，再用细胞培养液(以Sf900为主，含80U/mL的青霉素，80U/mL的链霉素和5％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗一次，清洗后直接用尖嘴镊把卵巢放入25cm2的细胞培养瓶中，盖紧瓶盖。这时卵巢的底面直接接触培养瓶底，放入摄氏27℃无光照的细胞培养箱中培养5小时。然后加入2mL上述细胞培养液，使卵巢组织完全浸没在该培养液中，放入同样条件下培养。以后每7天左右吸出半量的细胞培养液，并同时换入半量新的细胞培养液。在上述操作第3天后可以观察到从卵巢周围游离出大量单个的细胞，并逐渐向外围扩展，而此时卵巢组织一直保持蠕动状态。在第56天后见到增殖的细胞充满整个培养瓶，把含有新增殖出的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入2mL新的细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立昆虫细胞系的方法，包括如下步骤：（１）将实验昆虫浸没在乙醇溶液中１０－６０分钟，进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水清洗昆虫，再吸干虫体表面；（２）解剖昆虫，取出需要建立细胞系的完整昆虫组织或器官；（３）用生理盐水 清洗（２）中获得的组织或器官２－３次，再用细胞培养液清洗，清洗后把该组织或器官放入细胞培养瓶中，盖紧瓶盖，放入２５－２９℃无光照的细胞培养箱中培养４－２４小时；（４）加入适量的细胞培养液，使组织块完全或大部分浸没在该培养液中，在与步 骤（３）同样条件下培养；（５）每５－７天吸出半量的细胞培养液，并同时换入半量新的细胞培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；（６）把含有新增殖出的单个细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，并加入新 的细胞培养液，而原含有组织块的培养瓶中再加入同吸出量同样多的新的细胞培养液，两个培养瓶放入培养箱中培养，细胞开始传代，细胞系建立初步成功；整个过程都是在无菌条件下进行的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦启联，张寰，张永安，王玉珠，李瑄，苗麟，丁翠，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]