培养基组合物、培养方法和获得的成肌细胞及其应用技术

一种细胞培养基组合物，包括：　　　　（ｉ）人源和／或动物源的血清和／或血清成分　　　　（ｉｉ）胰岛素或后者的衍生物　　　　（ｉｉｉ）选自抗氧剂类和／或维生素类的一种或多种化合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于一种源自肌肉组织的祖细胞/干细胞的培养基组合物，涉及一种用于祖细胞/干细胞培养的方法，以及一种生产能够用作细胞/基因治疗产品的成肌细胞的方法。
技术介绍
已进行许多有关细胞培养方法的研究，以便获得富合成肌细胞的细胞部分，用于给予一般患有肌退化的患者，如迪谢纳肌营养不良。例如，这些研究中许多涉及到原始细胞的选择、培养条件、或细胞鉴定步骤。在这方面，可以提及文献US-A-5538722，其提出了用于体内合成肌蛋白的方法，该肌蛋白是由在培养中将DNA整合到成肌细胞而得到的，这些成肌细胞已经历至少5次细胞复制。文献US-A-5130141披露了一种用于获得源自培养物的肌源细胞以及先前已克隆的肌源细胞的方法，后者优越于前者，这是由于其优越的发展潜力。文献US-A-2001 0034061披露了通过受控使用缺氧培养来培养祖细胞以促进特定的分化的方法。最后，文献WO-A-01 94555提出了提供具有良好特性的肌源细胞群，其适合用于细胞治疗，特别是在细胞治疗中用于所需用途而制备的肌源细胞群。然而，有更少数的研究工作涉及培养基本身的组合物，其目的在于生产适用于细胞/基因治疗的细胞群。在后者之中，有欧洲申请EP-A-1048724，其涉及培养永生化肌细胞系的方法，即，其在大量传代后获得，其用于基因治疗“修复”缺损肌肉组织，或作为载体，一种或多种基因可以引入其中以便提供确定的产品。文献WO-A-97 00774教导一种用于改善获得移植物的方式，具体做法是在生长因子如bFGF和金属蛋白酶生成的诱导物存在的情况下，“预调节”供体的成肌细胞，以便增加移植的成肌细胞的移行距离并增加表达肌肉功能蛋白的融合成肌细胞的数目。文献WO-A-99 56785披露了一种生产肌细胞的方法，其在注射进肌功能障碍部位前进行遗传修饰该方法尤其用于治疗尿失禁。文献WO-A-01 78754涉及具有长期原位存活能力的祖细胞，其具有特定的表达细胞标记物的外形并且可用于治疗尿失禁。最后，文献WO-A-02 067867涉及一种用于制备干细胞的方法，它是利用细胞底物以结合后者它尤其用于泌尿治疗。因而包括上述现有技术的所有这些资料的文献，共有以下特点在实际细胞培养期间使用非补充的动物血清(非人血清，例如，牛或马血清)，后者可被认为足以供给细胞增殖所需要的所有元素。
技术实现思路
移植需要生产大量的成肌细胞，于是重要的是通过从源自肌肉组织的祖细胞/干细胞开始来改善该生产。本专利技术提出补充用于培养基的血清(或血清成分)，因而使得优化培养基成为可能。因此，可以缩短培养时间。因而该优化使得使用较少的血清(或血清成分)成为可能，其在人血清的情况下是必要的，其的可获量有限并且同时可以无需使用动物蛋白，而动物蛋白是朊病毒或病毒污染的潜在来源。为了解决从祖细胞/干细胞开始生产成肌细胞的优化问题，本专利技术提出细胞培养基组合物，其包括(i)人起源和/或动物起源的血清和/或血清成分(ii)胰岛素或后者的衍生物(iii)一种或多种选自抗氧化剂和/或维生素的化合物。可以使用牛源、优选人源的血清和/或血清成分。有利地，人血清的浓度小于5％(体积)，以及更有利地在1％至3％(体积)之间。通常，胰岛素衍生物选自IGFs、以及钒酸盐型胰岛素模拟物(insulomimetics)。有利地，维生素是抗坏血酸，而抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸或硒。在一个具体实施例中，还可以使用选自FGF型生长因子的一种或多种化合物。通常，此生长因子选自bFGFs、FGF-2至FGF-10。在另一个具体实施例中，如果合适的话，培养基可以包括糖皮质激素。在另一个具体实施例中，培养基组合物还包括脂磷脂酸和/或一种或多种化合物，其来自EGFs、heregulins(一种神经调节素)、凝血酶、PDGF、甲状腺激素、以及LIF。本专利技术还涉及培养祖细胞和/或干细胞的方法，其中在细胞扩增步骤期间将先前介绍的组合物用作培养基。根据一个具体实施例，细胞分化步骤是在细胞扩增步骤之前、期间、或之后进行。通常，使用的人血清与祖/干细胞是自体的。本专利技术还涉及通过实施先前介绍的方法来生产成肌细胞的方法。根据一个具体实施例，祖细胞和/或干细胞是通过细胞提取步骤从肌肉组织获得。有利地，提取步骤通过酶消化来进行。根据另一个具体实施例，对获得的细胞进行收集和分离。通常，细胞的收集和分离是通过酶消化接着离心和/或过滤来进行。此外可以省去酶消化步骤。根据另一个具体实施例，试验了成肌细胞形成集落的适用性。根据另一个具体实施例，进行细胞表征。有利地，使用了细胞周期标记物。根据另一个具体实施例，进行了冰冻成肌细胞的步骤。本专利技术还涉及在培养基中的细胞群，其包括祖/干细胞或成肌细胞或后者的混合物。根据本专利技术，按照前述方法生产的成肌细胞可以用于细胞治疗。优选地，它们用于制备产品，该产品用于治疗尿失禁或功能治疗小肌(这些肌(特征在于其较小的尺寸)的非完全清单包括括约肌如尿道或肛门括约肌、眼睑肌、手指肌、以及喉肌)。根据另一个具体实施例，如此生产的成肌细胞用于基因治疗。最后，本专利技术涉及生产的成肌细胞用于毒理学和/或药理学筛选。通常，该筛选的目的在于检测横纹肌溶解症涉及的一种或多种物质。附图说明根据下文结合附图进行的本专利技术的具体实施例的描述，本专利技术的其它特征和优点将变得显而易见，其中图1是矩形图，其表示在每单位表面积上人肌细胞的细胞核数目，其中使用以下培养基(A)没有生长因子；(B)含有5％的根据本专利技术的人血清；(C)FGF+胰岛素+PDGF+EGF+地塞米松+凝血酶(混合物M)；(D)相应于(B)+(C)，以及含有20％胎牛血清的“FCS”培养基。图2A示出了加入培养基的地塞米松的剂量(浓度为0至10-6M)对来自传23代的大鼠细胞的增殖的影响，其中培养基含有胎牛血清(FCS)并补充以胰岛素和FGF。图2B示出了地塞米松的特性研究。观察了在含有胎牛血清(FCS)并补充以胰岛素和FGF的培养基中，加入10-7M地塞米松、或另外的固定剂量(10-7M)的类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮、DEHA、SDEAH、醛固酮)对细胞生长的影响。还与抗孕激素RU486结合对地塞米松进行了试验。图3示出了洛伐他汀对肌细胞和脂肪细胞的毒性的比较研究。图4示出了在人临床应用中不同抑制素对人肌细胞的毒性的比较研究。具体实施例方式在图2A和图2B中，染色强度(此处由暗斑表示)随细胞密度的增加而增加。对于每种浓度用三个培养孔进行试验。本专利技术首先涉及用于细胞增殖和/或分化的培养基组合物。尤其可以使用这种培养基以便确保肌祖细胞和/或干细胞在成肌细胞中的增殖和分化。除基础营养培养基之外，本专利技术的培养基组合物包括最少量的人源和/或动物源血清、胰岛素(或其衍生物之一)、以及抗氧化剂、和/或维生素。所使用的基础营养培养基用依赖于或不依赖于CO2浓度的缓冲液进行缓冲。优选培养基中不含N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸作为缓冲剂，因为15mM的浓度会长期抑制人肌细胞的生长。在大多数情况下，使用的培养基由DME型、Ham F12型、以及MEMα型培养基的混合物构成。在这些混合物之中，还可以提及例如DME/F12和DME/MCDB 202混合物。在培养祖细胞和/或干细胞期间尤其适合的基础营养培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂安·潘塞，
申请(专利权)人：赛罗哥斯公司，
类型：发明
国别省市：