培养基组合物制造技术

本发明专利技术提供一种细胞及/或组织的培养方法，其特征在于，使用下述培养基组合物以悬浮状态培养细胞及/或组织，所述培养基组合物在液体培养基中添加纳米纤维，该纳米纤维在该溶液中均匀地分散，在不实质地提高该溶液的粘度的情况下实质地保持细胞及/或组织，从而具有防止其沉淀的效果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及培养基组合物及其用途，所述培养基组合物用于使用多糖类等纳米纤维(提高了向水中的分散性)、特别是以三维或悬浮状态培养动植物细胞及/或组织。
技术介绍
近年，用于对在动物和植物机体内发挥不同作用的多种器官、组织和细胞进行体外增殖或维持的技术在不断发展。对这些器官、组织进行的体外增殖或维持分别被称为器官培养、组织培养，对从器官、组织分离的细胞进行的体外增殖、分化或维持则被称为细胞培养。细胞培养是将经分离的细胞在培养基中进行体外增殖、分化或维持的技术，是为了详细分析生物体内各种器官、组织和细胞的功能和结构而必不可少的技术。此外，通过该技术培养的细胞和/或组织被用于以下多个领域：化学物质、药品等的药效和毒性评价；酶、细胞生长因子、抗体等有用物质的大规模生产；对因疾病、肢体欠损而失去的器官、组织、细胞加以弥补的再生医疗；植物品种改良；基因重组作物的制造等。来自动物的细胞基于其性状被大体分为悬浮细胞和粘附细胞两大类。悬浮细胞是生长和增殖不需要支持物的细胞，粘附细胞是生长和增殖需要支持物的细胞，构成生物体的大部分细胞是后者即粘附细胞。作为粘附细胞的培养方法，已知有单层培养、分散培养、包埋培养(embedded culture)、微载体培养、及球体培养(sphere culture)等。单层培养是将培养容器(由玻璃或各种经过表面处理的合成高分子材料制成)或者被称为饲养细胞(feeder cell)的辅助细胞作为支持物、对目标细胞进行单层状培养的方法，是最广为常见的。已经开发了利用各种形状或性状的培养容器的培养方法，所述培养容器例如为：对聚苯乙烯实施了各种表面处理(等离子体处理、电晕处理等)的培养容器，涂布有胶原蛋白、纤连蛋白、多聚赖氨酸等细胞粘附因子的培养容器，或者预先接种了饲养细胞的培养容器等。然而，单层培养存在如下问题：由于其二维培养环境与生物体内环境完全不同，所以无法长期维持细胞在生物体内具有的特异性功能，无法重构与生物体内同样的组织；由于相对一定面积而言的细胞数存在限度，所以不适合于细胞的大量培养；等等(专利文献1)。此外，在饲养细胞上培养目标细胞的方法会有饲养细胞与目标细胞的分离成为问题的情况(非专利文献1)。分散培养是下述这样的培养方法：在培养基中接种细胞后，在实施了阻碍细胞附着的表面处理的培养容器中连续搅拌其培养液，由此阻碍细胞向培养容器的粘附，以悬浮状态培养粘附细胞。然而，对被以该方法培养的粘附细胞而言，向支持物的粘附是无法实现的，因此，该方法不能应用于为进行细胞增殖而必须粘附于支持物的细胞。另外，还有可能由于时常因剪切力而破碎导致无法发挥出本来的细胞功能，所以无法对具有功能的细胞进行大量培养的情况(非专利文献2)。包埋培养是在琼脂、甲基纤维素、胶原凝胶、明胶、纤维蛋白、琼脂糖、藻酸盐等固体或半固体的凝胶基材中包埋细胞、将其固定来进行培养的方法。该方法由于能够以近似生物体内的状态三维培养细胞，并且有时凝胶基材自身也能促进细胞的增殖和分化，所以，与单层培养、分散培养相比，该方法能够以维持细胞功能的状态高密度地培养细胞(专利文献2、3)。此外，也开发了下述培养细胞的方法：以将细胞包埋于这些凝胶基材中的状态制成大小为100～300μm的微囊，在使该微囊分散的状态下在水溶液培养基中培养细胞(非专利文献3)。然而，这些方法具有如下问题：凝胶基材不透过可见光时无法进行对培养细胞的连续观察；由于含有凝胶基材的培养基、微囊具有高粘度，所以为了从培养基中回收细胞需要酶处理(例如，在胶原凝胶的情况下，胶原酶处理)等复杂且对细胞造成损害的操作；长期培养时所必需的培养基更换工作难于进行，等等。近年，已经开发了通过热、剪切力等处理使得细胞能够从凝胶基材中回收的技术，然而，热、剪切力等有可能对细胞功能产生不良影响，而且，该凝胶基材对生物体的安全性尚未明确(专利文献4、5，非专利文献4、5、6、7)。此外，在食品领域已经开发了溶胶状食品(以使切成小块的水果、蔬菜等粒状食品均匀分散、悬浮，并防止其沉淀、漂浮)，但是，对这类溶胶状食品而言未考虑过将分散的粒状食品回收的问题，没有研究过细胞、组织能否以悬浮状态进行培养的问题(专利文件6)。已知水溶液中的胶凝糖(Gellan)在钙离子的作用下凝胶化，形成微细结构(非专利文献8)微载体培养是下述这样的方法：在比水稍重的微粒(下文也称为微载体)的表面上使细胞进行单层增殖，在烧瓶等培养容器内搅拌该微粒，进行悬浮状态下的培养。通常，该方法中使用的微载体是直径100～300μm、表面积3000～6000cm2/g、比重1.03～1.05的球状粒子，由葡聚糖、明胶、藻酸或聚苯乙烯等材料构成。在微载体的表面也可以赋予胶原蛋白、明胶或二甲基氨基乙基等带电基团以使细胞易于附着。由于该方法可以极大地增加培养面积，所以能应用于细胞的大量培养(专利文献7、8)。然而，产生如下问题：难以使目标细胞以近乎均匀的方式附着至所有微载体上，另外，在搅拌中剪切力的作用下细胞从微载体上脱离，细胞受到损害，等等(非专利文献9)。球体培养是下述这样的培养方法：使目标细胞形成由数十～数百个细胞构成的聚集体(下文中也称为球体(sphere))，之后在培养基中对该聚集体以静置或振荡进行培养的方法。球体中，细胞密度高、与生物体内环境近似的细胞-细胞相互作用和细胞结构体得以被重构，与单层培养、分散培养方法相比更能以长期维持细胞功能的状态进行培养，这是已知的(非专利文献10、11)。然而，对于球体培养而言，在球体的大小过大时，球体内部的营养成分的供给和残屑废物的排出困难，因此，无法形成大的球体。另外，由于形成的球体需要在培养容器的底面以分散状态进行培养，所以难以增加相对一定体积而言的球体数，不适于大量培养。此外，作为球体的制作方法，已知有悬滴培养、在细胞非粘附表面上培养、微孔内培养、旋转培养、利用细胞支持物的培养，通过离心力、超声波、电场·磁场进行的凝聚等，但是这些方法的问题在于：操作复杂，球体的回收困难，大小控制和大规模生产困难，对细胞的影响未知，需要特殊的专用容器、设备，等等(专利文献9)。另一方面，对于植物而言，也可以以无菌状态对细胞、除去了细胞壁的原生质体或植物的叶、茎、根、生长点、种子、胚、花粉等器官、组织、愈伤组织(callus)进行培养、增殖。使用这样的植物的组织、细胞的培养技术，植物的品种改良、有用物质的生产也成为可能。作为用于在短时间内大量增殖植物细胞、组织的方法，已知有将植物细胞、组织在液体培养基中进行悬浊培养的方法(非专利文献12)。为了实现其良好的增殖，供应足够的氧、维持均匀的混合状态、以及防止细胞破损等是重要的。关于向培养液中供氧以及对细胞、组织的悬浊，存在将通气和机械搅拌组合进行的方式，以及仅通过通气来进行的方式，但是，对于前者而言，存在因搅拌导致的细胞、组织破损而引起增殖不良的情况，另一方面，对于后者而言，虽然对细胞、组织的剪切较少，但存在如下问题：在高密度培养中有时难以维持均匀的混合状态，因此细胞、组织沉积，增殖效率降低，等等。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2001－128660号公报专利文献2：日本特开昭62－171680号公报专利文献3：日本特开昭63－20958本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物能使细胞或组织悬浮进行培养，且所述培养基组合物含有纳米纤维。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.23 JP 2014-010842;2014.06.16 JP 2014-123771.一种培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物能使细胞或组织悬浮进行培养，且所述培养基组合物含有纳米纤维。2.如权利要求1所述的培养基组合物，其中，在培养时的培养基组合物的更换处理及培养结束后，可以回收细胞或组织。3.如权利要求1所述的培养基组合物，其中，在回收细胞或组织时，温度改变、化学处理、酶处理及剪切力均不需要。4.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，粘度为8mPa·s以下。5.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述纳米纤维的平均纤维直径为0.001～1.00μm，平均纤维长度(L)相对于平均纤维直径(D)的比(L/D)为2～500。6.如权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述纳米纤维由高分子化合物构成。7.如权利要求6所述的培养基组合物，其特征在于，所述高分子化合物为多糖类。8.如权利要求7所述的培养基组合物，其中，所述多糖类包括：选自由纤维素、甲壳质及壳聚糖组成的组中的任意的非水溶性多糖类；或者选自由透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、鼠李聚糖胶、迪特胶、黄原胶、卡拉胶、汉生胶、已糖醛酸、岩藻多糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖、藻酸及它们的盐组成的组中的水溶性多糖类。9.如权利要求8所述的培养基组合物，其中，所述多糖类包含纤维素或者甲壳质。10.如权利要求9所述的培养基组合物，其特征在于，所述纳米纤维是通过粉碎得到的。11.如权利要求1～10中任一项所述的培养基组合物，所述培养基组合物用于细胞培养。12.如权利要求11所述的培养基组合物，其特征在于，所述细胞为粘附细胞或悬浮细胞。13.如权利要求12所述的培养基组合物，其特征在于，所述粘附细胞为球体。14.一种细胞或者组织培养物，其含有细胞或者组织，并且含有权利要求1～13中任一项所述的培养基组合物。15.一种细胞或...

【专利技术属性】
技术研发人员：林寿人，大谷美沙代，猿桥康一郎，西野泰斗，岩间武久，金木达朗，相原彩子，
申请(专利权)人：日产化学工业株式会社，国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP