一种双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术制备了双酚S完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，得到一株产生双酚S抗体的杂交瘤细胞株CGMCC No.14686。此细胞株分泌的单克隆抗体，对双酚S具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.2ng/mL)。本发明专利技术成果可用于建立食品接触材料中双酚S迁移量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

A hybridoma cell line of bisphenol S monoclonal antibody and its application

The invention discloses a hybridoma cell line of bisphenol S monoclonal antibody and its application, and belongs to the field of food safety immunization detection. Bisphenol S complete antigen prepared in the invention, and compared it with the equal volume of Freund's adjuvant mixed and emulsified completely, by subcutaneous injection of BALB/c mice immunized by hybridoma cell strain CGMCC No.14686 strains producing bisphenol S antibody. The monoclonal antibodies secreted by this cell line have good specificity and sensitivity for the detection of bisphenol S (IC50 value is 0.2ng/mL). The results of the invention can be used to establish an immunoassay method for the migration of bisphenol S in food contact materials, which is of practical application value.

【技术实现步骤摘要】
一种双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一种双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
双酚S(BisS)化学名为4，4-二羟基二苯砜，是一种重要的农药、染料、助剂的中间体，可以作为聚碳酸酯、环氧树脂、聚酯树脂、聚砜和聚醚砜的原料。被广泛用于禁止或限制双酚A使用的日常用具的制造，如食品包装材料、食品罐内衬、奶瓶和纸制品等。随着人们对食品安全问题的关注度不断上升，在曝出双酚A的诸多问题后，许多塑料制品厂家开始用双酚S取代双酚A。但双酚S与双酚A结构相似，同属于环境雌激素类物质，可以通过包装材料迁移至食品中，对人体产生潜在危害，能影响生物体内的雌性激素，摄入过多会导致内分泌失调，同时双酚S还会导致新陈代谢紊乱从而引发肥胖。还有研究显示双酚S对淋巴细胞具有增值作用，当双酚S的浓度为2～20mg/L时，促进作用最为显著。目前关于双酚类化合物检测方法还不成熟，需要建立一种灵敏度高的检测方法来监测双酚类化合物在食品包装材料的应用及食品中的迁移量分析。因此建立快速简便的双酚S检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的首先是提供一株双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14686，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。由该细胞株制备的抗体对双酚S具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立双酚S的免疫学检测方法。本专利技术的第二个目的在于提供一种双酚S单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.14686的双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。所述双酚S单克隆抗体的应用，用于食品接触材料检测中双酚S迁移量的分析检测。本专利技术的第三个目的在于提供制备所述双酚S免疫原的方法，主要包括以下步骤：1)合成半抗原BisS：将4，4’-二羟基二苯砜完全溶解后，加入氢氧化钠固体，加热回流后加入4-溴丁酸甲酯，继续反应后调节pH值约3-4，TLC监测，出现少量二取代产物后淬灭反应；加入饱和食盐水充分振荡后静置分层，分去水相，有机相用无水硫酸钠干燥，静置一段时间后，过滤除掉硫酸钠，减压蒸去溶剂，粗产物经过柱色谱分离得到纯净的产物a；将化合物a溶解，在搅拌下按比例加入KOH溶液，室温搅拌后调节反应体系pH值约为3，淬灭反应；加入饱和食盐水充分振荡后静置分层，分去水相，有机相用无水硫酸钠干燥，静置一段时间后，过滤除掉硫酸钠，减压蒸去溶剂，粗产物经过柱色谱分离得到纯净的产物b，即半抗原BisS。2)完全抗原的制备：免疫原BisS-KLH的制备：称取半抗原BisS，1-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解得到A液；取钥孔血蓝蛋白KLH，用硼酸缓冲溶液溶解得到B液，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物BisS-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原BisS-KLH。本专利技术的第四个目的在于提供制备所述双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，主要包括以下步骤：(1)小鼠的免疫：将免疫原BisS-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用BisS-KLH完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制；(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株；(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对双酚S具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.2ng/mL)，为检测食品接触材料中双酚S迁移量提供了免疫学方法。本专利技术提供的双酚S单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测双酚S的试剂盒，具有实际应用价值。生物材料保藏一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14686，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明图1CGMCCNo.14686分泌的单克隆抗体对双酚S的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将双酚S完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对双酚S有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株1C12的制备(1)完全抗原的制备：半抗原合成路线如下：在10mL圆底烧瓶中加入1g(4.0mmoL，1eq)4，4’-二羟基二苯砜，再加入约6mL水，加热至94℃使4，4’-二羟基二苯砜溶解。待其完全溶解后，加入0.24g(6.0mmoL，1.5eq)氢氧化钠固体，加热回流1h后加入4-溴丁酸甲酯，继续反应约30h后加盐酸调节pH值约3-4。TLC监测，出现少量二取代产物后淬灭反应。反应体系用乙醚(30mL×3)萃取，所得有机相合并后加入饱和食盐水(10mL)充分振荡后静置分层，分去水相。有机相用无水硫酸钠干燥，静置一段时间后，过滤除掉硫酸钠，减压蒸去溶剂。粗产物经过柱色谱分离得到纯净的产物a(产率40％)。将0.55g(1.5mmoL，1eq)化合物a溶解在10mL甲醇中。在磁力搅拌下加入配置好的2mol/L的KOH溶液(n(KOH)：n化合物a＝6:1)，室温搅拌48h后加盐酸调节反应体系pH值约为3，淬灭反应。反应体系用乙醚(30mL×3)萃取，所得有机相合并后加入饱和食盐水(10mL)充分振荡后静置分层，分去水相。有机相用无水硫酸钠干燥，静置一段时间后，过滤除掉硫酸钠，减压蒸去溶剂。粗产物经过柱色谱分离得到纯净的产物b，即半抗原BisS。b、称取1.2mgBisS，1-乙基碳二亚胺盐酸盐2.2mg，N-羟基琥珀酰亚胺1.3mg，用400μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A1液，室温搅拌反6-8h。取钥孔血蓝蛋白KLH10mg(BisS与KLH摩尔比为1500:1)，用4mL硼酸缓冲溶液溶解，得到B1液，在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应过夜，即得偶联物BisS-KLH(1500:1)混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原；按照以上步骤，再分别制备BisS与KLH摩尔比为3000:1和4500:1的完全抗原，得到偶联物BisS-KLH(30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14686，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一株单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14686，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种制备双酚S单克隆抗体的方法，其特征在于，由权利要求1所述单克隆细胞株分泌产生。3.一种检测双酚S的方法，其特征在于，利用权利要求1所述单克隆细胞株自身或其分泌产生的双酚S单克隆抗体。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，林璐，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32