一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用。所述伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV‑DX，保藏号为CGMCC No.14326。本发明专利技术猪伪狂犬病毒毒株PRV‑DX从经免疫过疫苗的猪场里出现的伪狂犬病病猪身上分离纯化到的一株新的猪伪狂犬病毒，该毒株属于II型伪狂犬病毒，对猪的致病力要远远强于经典的PRV标准强毒株SC株，该病毒在Vero细胞传代后，毒价逐渐升高至第8代后趋于稳定，最高可达10

A type II pseudorabies virus strain and its application

The invention discloses a type II pseudorabies virus virus strain and its application. The pseudorabies virus strains, named pseudorabies virus PRV DX, No.14326 preservation number is CGMCC. The invention of pseudorabies virus PRV strain DX from immunized vaccine of swine pseudorabies disease in pigs isolated a new strain of pseudorabies virus, the virus belongs to the II type of swine pseudorabies virus, pathogenicity is much stronger than the classical PRV standard virulent virus SC strains, the virus in Vero cells, the virus titer gradually increased to the eighth generation tends to be stable, up to 10

【技术实现步骤摘要】
一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种Ⅱ型伪狂犬病毒毒株及其应用。
技术介绍
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PrV)引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行。可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。已经给世界养猪业带来巨大的经济损失。目前，有很多欧洲国家宣布通过免疫基因缺失疫苗并结合相关的血清学诊断技术根除了伪狂犬病。我国也通过基因缺失疫苗以及弱毒疫苗有效控制了伪狂犬病的流行趋势。但是，2012年来，我国部分免疫过疫苗的猪场出现了伪狂犬病的返强。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。PRV对环境的抵抗力较其他疱疹病毒略强一些，夏季时在猪舍干草上存活时间能达到30天，冬天可达46天。对热的抵抗力较强，在煮沸的水中还可存活一分钟。常温和低温时也都能保持其稳定性，但是存活时间不同，其中4℃时病毒能存活20周，-40℃或-70℃可存活数年，而-20℃时只能存活3个月。将组织病料经50％甘油盐水处理后保存于4℃150天，其感染力只略微减弱。PRV在不同pH条件下也较稳定，可适应pH4.0～12，甚至在极端pH中还能存活至少2小时。PRV对乙醚、氯仿、1％NaOH等试剂较敏感，可用这些试剂杀灭容器中的病毒。同时，病毒也对福尔马林和紫外照射敏感。PRV基因组为一条双链DNA，全长约150kb，G+C含量约70％，含有至少70个基因，编码约100种病毒蛋白。其基因组有一部分为共线性排列，这些共线性排列的基因具有相类似的功能。根据PRV感染细胞后的转录翻译情况，可以将PRV基因分为立早期基因、早期基因和晚期基因，这三类基因依次以级联的方式进行调节。PRV核衣壳主要由UL19基因、UL35基因编码的蛋白构成，衣壳直径约125nm。PRV病毒粒子核衣壳与囊膜之间存在被膜蛋白，其中至少有14种蛋白来自病毒基因组编码，同时被膜层还含有宿主细胞的肌动蛋白。PRV的囊膜蛋白几乎能在所有感染的细胞上发现。对蛋白质功能确定的有11种糖蛋白，即gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN。其中gB、gD、gH、gL是病毒体外复制和感染所必需的糖蛋白，与PRV的神经传导有关；gC、gE、gG和gM是病毒复制的非必需糖蛋白，其中gC、gE与gI与PRV在神经细胞间的传导方向有关。这些基因的表达产物既是诱导机体产生体液免疫的主要病毒抗原，也是病毒作用于细胞的重要成分。PRV的毒力受到多个基因的联合控制，个别毒力基因的缺失能不同程度降低病毒的毒力。与其毒力有关的基因有UL区的UL10、UL13、UL21、UL23(TK)、UL39/40、UL44、UL50，US区的US3(PK)、US7、US8。其中TK或PK的缺失能导致病毒毒力的显著下降。
技术实现思路
本专利技术从经免疫过疫苗的猪场里出现的伪狂犬病病猪身上分离纯化到一株新的伪狂犬病毒毒株，为一种新的Ⅱ型伪狂犬病毒，对该毒株进行蚀斑纯化、基因组测定和生物学特性测定，确认为一株新流行的Ⅱ型伪狂犬病毒。猪伪狂犬病是OIE认定的B类传染病，该病历史较久，此前许多国家通过实施严格的清除计划，包括大规模使用gE缺失疫苗和DIVA(区分野毒感染和疫苗免疫)策略，在很大程度上控制了该病，北美和欧洲许多国家已经基本将PRV在猪群中净化，我国在上世纪90年代开始，通过接种Bartha-K61疫苗来防控该病，并取得了一定的效果。但2011年末开始，华北以及华东地区许多伪狂犬疫苗免疫合格的猪场又开始出现了典型的伪狂犬病病毒感染现象，2013年，疫情开始扩散到南方多省，以广东、广西等地区表现最为明显。2014年，福建、山西、云南等地猪场也出现新型伪狂犬病病毒感染，到目前为止，这种现象已基本遍布我国主要养猪区域。因此，本专利技术中新流行毒株的分离鉴定及应用对我国猪伪狂犬病毒流行病学调查及新流行强毒株的防控具有重要的意义。一种伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-DX，保藏号为CGMCCNo.14326。经基因测序及序列比对以及相关性能的检测得出本专利技术猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX为一种全新的猪伪狂犬病毒毒株，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo.14326，保藏时间为：2017年7月6日。本专利技术又提供了所述的伪狂犬病毒毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。本专利技术猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX可以用来制备相应的猪伪狂犬病疫苗，比如通过灭活的方法制备疫苗或通过基因工程方法通过敲除相关基因获得减毒疫苗等。优选的，所述疫苗为基因工程减毒疫苗。本专利技术还提供了所述的伪狂犬病毒毒株在作为伪狂犬病疫苗的检验用毒种中的应用。由于本专利技术猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX致病力强、毒价高，可以作为猪伪狂犬病疫苗的检验用毒种，用于检测猪伪狂犬病疫苗的效果。本专利技术还提供了所述的伪狂犬病毒毒株在制备伪狂犬病毒感染模型中的应用。所述的伪狂犬病毒毒株可以用于制备伪狂犬病毒感染的动物模型。本专利技术猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX从经免疫过疫苗的猪场里出现的伪狂犬病病猪身上分离纯化到的一株新的猪伪狂犬病毒，该毒株属于II型伪狂犬病毒，毒力比经典的伪狂犬病毒强2倍(小鼠)～20倍(猪)，100％致死小鼠和不同发育阶段的猪。该病毒在Vero细胞传代后，毒价逐渐升高至第8代后趋于稳定，最高可达109TCID50/mL。根据基因组特征和致病性特征分析确认本专利技术猪伪狂犬病毒毒株PRV-DX为一种新型的伪狂犬病毒，对我国猪伪狂犬病毒流行病学调查及新流行强毒株的防控具有重要的意义，可作为猪伪狂犬病毒相关研究与防控产品开发的毒种。附图说明图1为实施例1中病料上清接种vero细胞结果图，其中A为实验组，B为阴性对照组。图2为实施例1中病料上清抽取DNA后gE特异性基因片段扩增结果图，其中泳道M：DNAMarker，泳道1：实验组，泳道2：阴性对照组。图3为本专利技术毒株的生长曲线图。图4为gB基因进化树分析结果图。图5为gC基因进化树分析结果图。图6为gE基因进化树分析结果图。图7为全基因组核苷酸序列进化分析结果图。具体实施方式材料：临床上疑似猪伪狂犬病患病仔猪脑组织病料：来源于浙江湖州某猪场。Vero细胞系为实验室保存；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自上海生工有限公司；PrimeSTAR聚合酶、dNTPmix、2×GCbuffer、100bpMarker、pMD18-TKit均购自宝生物工程(大连)有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；MEM培养基购自Invitrogen；PCR产物清洁回收试剂盒、低熔点琼脂粉购自Sigma公司。PRV-SC病毒为传统的猪伪狂犬病毒株，购自中国兽医药品监察所。5-6周龄雌性Balb/c小鼠购自浙江省实验动物中心。60日龄实验猪购自宁波宁海跃龙街道元红农庄，经抗原抗体检测，实验猪PRV、P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV‑DX，保藏号为CGMCC No.14326。

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病病毒PRV-DX，保藏号为CGMCCNo.14326。2.如权利要求1所述的伪狂犬病毒毒株在制备伪狂犬病疫苗中的应用。3.如权利要求2所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，邢刚，顾金燕，金玉兰，尹笛，廖敏，颜焰，范春梅，周赟，郑肖娟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33