一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，本发明专利技术采用鸡肝细胞可高效扩增J亚群禽白血病病毒，利用鸡肝细胞可以更早产生高滴度病毒的特性，缩短J亚群禽白血病病毒分离检测时间，实现提早检测到病原，提高J亚群禽白血病病毒检测方法的敏感度。在J亚群禽白血病病毒感染MOI为0.001时，ELISA检测感染维持培养3天的鸡肝细胞的效果与感染维持培养7天的DF‑1细胞相当。本发明专利技术建立发高效扩增方法的将加快J亚群禽白血病病毒的净化进程，节约时间、成本，本发明专利技术在J亚群禽白血病病毒净化检测中具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法。
技术介绍
禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)是可引起禽类患多种肿瘤性免疫抑制疾病的反转录病毒。该病毒根据其囊膜蛋白特征可分为A-J共10个亚群，而A，B，C，D以及J亚群可引起鸡群患不同类型肿瘤的禽白血病病毒，这些病毒具有垂直和水平传播的能力。其中C，D亚群十分罕见。国内目前最常见的是J亚群，其次是A亚群和B亚群。患病鸡只常表现出产蛋率下降，消瘦，鸡只胴体废弃，鸡只死亡等，导致国内乃至世界范围内养禽业的巨大经济损失。因ALV无特效药物治疗，也没有疫苗可以使用，目前该病原的防控主要采取淘汰阳性鸡群的净化措施。ALV病毒分离鉴定的金标准是待检样品接种鸡胚成纤维细胞DF-1细胞系，维持7-9天后，以抗ALV群特异性抗原p27单克隆抗体进行间接免疫荧光(IFA)或者ELISA进行确诊。这种方法虽然可靠性高，但是耗时长。本专利技术利用鸡肝细胞作为ALV病毒分离细胞。与传统的DF1细胞比较，ALV在鸡肝细胞上的病毒滴度显著提高；ELISA检测时，感染的鸡肝细胞维持培养5天与DF-1细胞维持培养7天的效果相当或更佳。因此，利用能够高效扩增J亚群禽白血病病毒的鸡肝细胞作为病毒分离检测用细胞，将加快ALV的净化进程，节约时间、成本，在ALV净化检测中具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种高效扩增禽白血病病毒的方法，并实现提早检测到禽白血病病毒病原。本专利技术利用病毒复制速率显著高于DF-1细胞的鸡肝细胞来扩增J亚群禽白血病病毒，利用鸡肝细胞可以更早产生高滴度病毒的特性，实现提早检测到病原。本专利技术公开了可以高效扩增禽白血病病毒的鸡肝细胞。本专利技术还公开鸡肝细胞高效提高扩增J亚群禽白血病病毒的滴度，而且可以使ELISA检测分离病原时间大幅缩短，实现提早检测到禽白血病病原。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供的技术方案是：一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，包括以下步骤：1)鸡肝细胞的培养；2)鸡肝细胞高效扩增J亚群禽白血病病毒：将鸡肝细胞接种培养，在汇合度为70％时，将J亚群禽白血病病毒接种细胞，以含2％胎牛血清的培养基培养；3)J亚群禽白血病病毒的测定。步骤1)中，鸡肝细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。步骤1)中，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以0.25％的胰酶进行消化、传代至所需的细胞培养板中。步骤2)中，将鸡肝细胞接种培养，在汇合度为70％时，将J亚群禽白血病病毒接种细胞，MOI为0.001，做两个重复，以含2％胎牛血清的培养基培养7天，每天收集200μl上清冻于-80℃冰箱备用，同时每孔补200μl含2％胎牛血清的培养基。步骤3)中，测定收集上清的TCID50；利用GraphPadPrism5软件绘制J亚群禽白血病病毒生长曲线。鸡肝细胞能高效扩增J亚群禽白血病病毒，病毒效价可高达1.58×107TCID50/ml；鸡肝细胞可高效扩增J亚群禽白血病病毒，利用鸡肝细胞可以更早产生高滴度病毒的特性，缩短J亚群禽白血病病毒分离检测时间，实现提早检测到病原，提高J亚群禽白血病病毒检测方法的敏感度。在J亚群禽白血病病毒感染MOI为0.001时，ELISA检测感染维持培养3天的鸡肝细胞的效果与感染维持培养7天的DF-1细胞相当。本专利技术相比于现有技术具有以下有益效果：本专利技术的快速扩增禽白血病病毒的方法，可在较短时间内获得高滴度的病毒。本专利技术获得的快速扩增J亚群禽白血病病毒的方法，可直接用于快速获得高滴度J亚群禽白血病病毒；进行病毒分离时，与DF-1细胞相比，鸡肝细胞可以提前检测到病原，亦相当于提高检测方法的敏感度；并为进一步加快J亚群禽白血病病毒的净化项目具有重要意义。附图说明图1：J亚群禽白血病病毒在鸡肝细胞和DF-1细胞中的生长曲线(DF-1为J亚群禽白血病病毒在DF-1细胞中的生长曲线，CL为J亚群禽白血病病毒在鸡肝细胞在中的生长曲线)。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。1)细胞培养将鸡肝细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，DF-1细胞采用含5％胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以0.25％的胰酶进行消化、传代至6孔或96孔细胞培养板中。2)鸡肝细胞高效扩增J亚群禽白血病病毒将鸡肝细胞和DF-1细胞接种至6孔板内培养，在汇合度为约70％时，将J亚群禽白血病病毒GY03株接种两种细胞，MOI为0.001，两种细胞各做两个重复，以2ml含2％胎牛血清的培养基培养7天，每天收集200μl上清冻存于-80℃冰箱备用，同时每孔补200μl含2％胎牛血清的培养基；将DF-1细胞接种于96孔板中，在汇合度为约70％时，将收集的上清做10倍倍比稀释，每个稀释度4个重复，接种细胞，维持5天后，将细胞用100μl丙酮乙醇比例为3∶2的固定液固定10分钟，干燥；将100μl1∶150稀释的抗J亚群禽白血病病毒针对gp85的特异性单克隆抗体JE9为一抗与固定好的细胞于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μlPBS洗3遍；加入100μl1∶150稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μlPBS洗3遍，加入50μlPBS，于倒置荧光显微镜下进行观察；通过Reed-Muench法测定TCID50；利用GraphPadPrism5软件绘制病毒生长曲线。结果：同样培养7天，与传统的DF-1细胞比较，J亚群禽白血病病毒在鸡肝细胞上的病毒滴度显著高于DF-1细胞。3)鸡肝细胞缩短了J亚群禽白血病病毒分离检测时间将鸡肝细胞和DF-1细胞接种96孔板内培养，在汇合度为约70％时，将J亚群禽白血病病毒GY03株分别接种两种细胞，MOI为0.001和0.0001，两种细胞每个滴度各做两个重复，以200μl含2％胎牛血清的DMEM培养基培养7天，每天将上清收集冻存于-80℃冰箱备用。用已经建立好的针对J亚群禽白血病病毒P27抗原的夹心法ELISA对所收集的上清进行检测：将抗J亚群禽白血病病毒P27单克隆抗体5D3(3.5ug/ml)在4℃包被过夜，加入100μl收集的上清，37℃孵育1小时，弃去所有液体，PBST洗5遍，拍干；加入100μlHRP标记的抗J亚群禽白血病病毒P27单克隆抗体4F12，37℃孵育1小时，弃去所有液体，PBST洗6遍，拍干。加入100μlTMB于37℃孵育15分钟进行显色后，加入100μlSDS终止反应，用酶标仪读取OD630读值。读值低于0.10者为阴性，介于0.10与0.15间为疑似，大于0.15者为阳性。结果：在J亚群禽白血病病毒感染MOI为0.001时，ELISA检测感染维持培养3天的鸡肝细胞的效果与感染维持培养7天的DF-1细胞相当；在J亚群禽白血病病毒感染MOI为0.0001时，ELISA能从感染维持培养4天的鸡肝细胞中检测到J亚群禽白血病病毒，而在感染维持培养7天的DF1中未能检测到J亚群禽白血病病毒。ELISA检测J亚群禽白血病病毒在不同细胞上扩增培养效果比较见下表1：表1实验证明，鸡肝细胞可高效扩增J亚群禽白血病病毒，利用鸡肝细胞可以更早本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)鸡肝细胞的培养；2)鸡肝细胞高效扩增J亚群禽白血病病毒：将鸡肝细胞接种培养，在汇合度为70％时，将J亚群禽白血病病毒接种细胞，以含2％胎牛血清的培养基培养；3)J亚群禽白血病病毒的测定。

【技术特征摘要】
1.一种高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)鸡肝细胞的培养；2)鸡肝细胞高效扩增J亚群禽白血病病毒：将鸡肝细胞接种培养，在汇合度为70％时，将J亚群禽白血病病毒接种细胞，以含2％胎牛血清的培养基培养；3)J亚群禽白血病病毒的测定。2.根据权利要求1所述的高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，其特征在于：步骤1)中，鸡肝细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。3.根据权利要求1所述的高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，其特征在于：步骤1)中，待细胞长满单层后，用PBS洗涤一遍后，以0.25％的胰酶进行消化、传代至所需的细胞培养板中。4.根据权利要求1所述的高效扩增J亚群禽白血病病毒的方法，其特征在于：步骤2)中，将鸡肝细胞接种培养，在汇合度为70％时，将J亚群禽白血病病毒接种细胞，MOI为0.001，做两个重复，以含2％胎牛血清的培养基培养7天，每天收集200μl上清冻于-80℃冰箱备...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，李拓凡，孙舒，邵红霞，秦爱建，谢菁，吕璐，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32