本发明专利技术公开了胸腺素α原基因的新用途。本发明专利技术发明专利技术人的实验证实，ＰｒｏＴα能够显著改善动物对ＤＮＡ疫苗的反应性，可以用作ＤＮＡ疫苗免疫原性增强佐剂。胸腺素α原基因可以使乙肝病毒表面抗原ＤＮＡ疫苗、疟疾多表位抗原ＤＮＡ疫苗等各种ＤＮＡ疫苗免疫原性均得到增强，具有广谱性，是一种不可多得的ＤＮＡ疫苗免疫原性增强佐剂，在ＤＮＡ疫苗的生产和应用中意义重大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胸腺素α原基因的新用途，特别是涉及胸腺素α原基因在作为DNA疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。
技术介绍
胸腺素α原(Prothymosin α，ProTα)是由109～113个氨基酸残基组成的小分子蛋白。ProTα分子氨基酸残基总数的约50％为酸性氨基酸残基，且成簇分布于ProTα分子的中部，使分子具有很强的亲水性。ProTα分子中不含有分泌信号，而含有由两部分组成的核定位信号，主要分布在核内，与细胞增殖功能有关，血清中仅含有少量ProTα(约占全血ProTα的10％)。大鼠ProTα由111个氨基酸残基组成，人ProTα由110个氨基酸残基组成。人淋巴母细胞(PHA激活的淋巴细胞)膜表面存在着两类ProTα受体，说明ProTα具有免疫调节作用。1985年，Haritos等发现大鼠ProTα能增强小鼠抗白色念珠菌(Candidaalbicans)感染的能力，后来又发现ProTα能刺激转移抑制因子(MIF)的释放。1987年，Salvin等发现腹腔注射ProTα能增强RF/J小鼠产生抗体的能力，锌能加强这种作用，能使青年大鼠和老年大鼠的细胞免疫和体液免疫都增强。ProTα能延长白血病模型DBA/2小鼠的存活期，当腹腔注射ProTα时，能够增强巨噬细胞、NC细胞、LAK细胞的活性，并诱导IL-2和TNFα的产生，从而产生非特异性肿瘤杀伤作用，同时，诱导肿瘤特异性细胞毒T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+)的特异性抗肿瘤作用。另外，ProTα还具有诱导CD4+T淋巴细胞产生IL-2和IL-2R(IL-2受体)的能力，增强人和小鼠淋巴细胞的MHC II类抗原和mRNA的表达。DNA疫苗是指携带有抗原蛋白基因及表达必要的调控元件的质粒DNA的表达载体。将其导入到宿主的有机体中，可诱导机体产生免疫应答，达到免疫的目地。这种方法与传统的活病毒疫苗或亚单位疫苗相比，有如下优点易于构建；规模化生产成本低廉；以天然抗原形式被免疫系统识别，可诱导产生细胞和体液免疫；可诱导机体产生长期持久的免疫力；制剂稳定；可组建多价复合疫苗联合免疫。但是，有些抗原基因的免疫原性比较弱，单独注射这些疫苗不能诱发足够的保护性免疫。因此，寻找合适的DNA疫苗佐剂，提高免疫反应及其免疫效果，意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供胸腺素α原基因在作为DNA疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。本专利技术专利技术人的实验证实，ProTα能够显著改善动物对DNA疫苗的反应性，可以用作DNA疫苗免疫原性增强佐剂。在实际应用中，胸腺素α原基因的来源是广泛的，可以是人源的，也可以是鼠源的，还可以是其它动物来源的。胸腺素α原基因与DNA疫苗的基因可以存在于不同的重组质粒中，使用时联合注射，也可以使胸腺素α原基因与DNA疫苗的基因融合，形成一个重组质粒，使用起来会更方便。当然，在制备该佐剂时，也不排除添加其它药学上可接受的辅料及载体。胸腺素α原基因可以使各种DNA疫苗免疫原性得到增强，具有广谱性，是一种不可多得的DNA疫苗免疫原性增强佐剂，在DNA疫苗的生产和应用中意义重大。附图说明图1为质粒pThα和TLH的酶切鉴定图谱。图2为质粒pS2S的酶切鉴定图谱。具体实施例方式实施例1质粒的制备1、含有胸腺素α原基因的重组质粒pThα的构建使用上游引物5’cgcggatccatgtctgatgcagctgtagatacc-3’(BamHI)，下游引物5’ccggaattcgtc atcctcgtcggtcttctg-3’(EcoRI)，以人胎肝cDNA文库为模板，扩增胸腺素α原基因(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，55℃，20秒，72℃，30秒，25个循环；(3)72℃，5分钟。PCR产物经凝胶电泳后回收，再用KpnI和EcoRI酶切得到的基因片段，将其克隆入同样酶切的质粒载体pcDNA3(Invitrogen，USA)上，得到重组质粒pThα。转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆，经DNA序列分析正确(序列1)，其编码的氨基酸序列为序列表中的序列2。该质粒的酶切鉴定图谱如图2所示，图中1为pTha，约330bp；2和4分别为Marker DL-2000和DL-15000。2、含有乙肝表面抗原基因的重组质粒pS2S的构建使用上游引物B2 5’GGAAGATCTCAGGCCATG CAGTGGA ATT-3’(BglII)；和下游引物S3 5’AGGGGGCCCAGCCCATGAAGTTTAGGGAA-3’(ApaI)，从HBV2质粒(张彤等；中华微生物和免疫学杂志。1997，16(6)421-424)扩增出乙肝表面抗原中蛋白(preS2.S)基因片段，PCR程序如下(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，58℃，30秒，72℃，50秒，25个循环；(3)72℃，5分钟。PCR产物经凝胶电泳后回收，然后用BamHI和ApaI酶切该基因片段，克隆入pcDNA3(Invitrogen公司)载体的多克隆位点BamHI和ApaI之间，得到重组质粒pS2S。转化大肠杆菌DH5α，挑选正确克隆，经DNA序列分析正确后用于后述研究，其酶切鉴定图谱如图1所示，图中1为pS2S，约841bp；2为Marker DL-2000. 3、含有胸腺素α原和乙肝表面抗原融合基因的重组质粒TLH的构建用于构建融合基因的pS2S引物上游引物S1 5’CCCaagcttCA GG C CA TG CAGTGGAATT-3’(HindIII)，下游引物S25’TTTTCCTTTTgcggccgc AGCCCAT GAA GTTTAGG GA-3’(NotI)，以HBV2质粒为模板，其PCR程序如下(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，55℃，30秒，72℃，55秒，25个循环；(3)72℃，5分钟。PCR产物经凝胶电泳后回收，然后使用HindIII和NotI双酶切该基因片段，与Linker(其核苷酸及编码蛋白的序列分别为序列表中的序列3和序列4)一起在T4连接酶的作用下，克隆入胸腺素α原基因下游，形成pTha-Linker--pS2S重组质粒，命名为TLH。Linker上游引物5’gaattcttcggtggcggctccggtgggggca-3’(EcoRI)。下游引物5’gaggccaccgccgaggccacccccgttcgaa-3’(HindIII)。Linker的两条引物为互补序列，只须经过变性和复性过程，即可形成带酶切位点双链片段。其PCR程序如下95℃，5分钟；50℃，50分钟即可。该质粒的酶切鉴定图谱如图2所示，图中3为TLH切出pTha和pS2S两个片段；2和4分别为Marker DL-2000和DL-15000。4、含有疟疾多表位抗原基因的重组质粒AWTE的构建使用上游引物5’cgcggatccatgaacgctaaccctgg tgat-3’(BamHI)，下游引物5’agggggcccttacgatggtaccacaacgtt-3’(ApaI)。从CTB-AWTE重组质粒上扩增AWTE片段(钟辉等。科学通报.43(13)1417-1422.)。其PCR程序如下(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，45℃，20秒，72℃，30秒，5个循环本文档来自技高网...
【技术保护点】
胸腺素α原基因作为ＤＮＡ疫苗免疫原性增强佐剂的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马清钧，靳彦文，曹诚，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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