一种重组人胸腺素β１６的制备方法，属于生物工程领域。本发明专利技术的目的是采用基因工程技术制备重组胸腺素β↓［１６］。本发明专利技术重组人胸腺素β１６的氨基酸序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１。本发明专利技术Ｔβ↓［１６］作为胸腺素家族成员之一，在促进伤口愈合的作用中不同于市场上应用的或正在开发中的同功药物。Ｔβ↓［１６］不是生长因子，与各种生长因子相比在治疗伤口愈合上有许多优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域。
技术介绍
胸腺素是一类家族多肽的统称，它们广泛存在于人体及动物体 内。这些小分子多肽由40~45个氨基酸组成，家族成员间的序列高度保守，分子量大多在5kDa左右，是一类具有极性的多肽分子。根据家族成员各自的等电点差异，胸腺素可被分为a型、p型和 Y型。其中，由于在各种生理生化过程中都起到重要的作用，(3型家 族成员的作用及作用机制逐渐成为了近年来的研究热点之一。国外化 学合成的胸腺素3 4应用于角膜修复和皮肤烧烫伤、溃疡修复等己经 进入II期临床。但采用化学合成法，成本高，易造成环境污染。(3型家族的16个成员中，含量最多、组织分布最广的是胸腺素 T(34， T卩4不但在调节免疫系统、神经系统功能和发育方面具有重要 作用，还可调节肌动蛋白的聚合与分离。而最重要的，也是目前基础 医学研究和临床应用研究均集中的方面一一血管再生作用,血管再生 是创伤后愈合的前提条件。而丁(316是新近发现的家族成员，其研究 尚不深入，且数据积累少，现已知其在功能域部分与Tp4具有高度的 同源性，如下表所示。5 10 15 20 25 3035 40一TP16aCSDKP DLSEV EKFDRSKLKK潔EE隨LPSKET， QQEKE CVQTS TP4 aC邻KP DMAEI EKFDKSKL隨TETQEKiiPLPSKETI EQEKQ AGES二者差异仅为一个氨基酸，而且二者在二级结构上并无明显差 异，因此，对T(3化的性质及药理药效研究可以参照T(34的研究方法进行。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用基因工程技术制备重组胸腺素(316。 本专利技术重组人胸腺素P16的氨基酸序列SEQ ID NO: 1。 本专利技术sumo融合重组胸腺素P 16的氨基酸序列SEQ ID NO: 2。 本专利技术重组人胸腺素P 16的原核表达制备方法是利用SUMO作为高效表达重组蛋白的融合标签，构建pET/SUMO- 丁(316大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素3 16。本专利技术重组人胸腺素3 16的原核表达制备方法是利用GST作为表达重组蛋白的融合标签，构建了 pGEX- T(3化大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素ei6。本专利技术重组人胸腺素e 16的原核表达制备方法是利用pTW-TP16融合蛋白基因在大肠杆菌表达出CBD-inteinl-TP 16-intein2-CBD融合蛋白，通过几丁质柱层析，温度及pH的改变即可诱导内含肽 (intein)发生裂解，释放出目的蛋白T卩化。本专利技术重组人胸腺素P 16的真核表达制备方法是a、利用毕赤酵母偏好的密码子合成丁(316基因，构建pPIC9K/T3 16工程菌；b、 酵母工程菌培养采用甲醇诱导；c、 重组人胸腺素(316的制备与纯化是收集上清，经Ni-chdating Sepharose亲和层析纯化蛋白，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋 白。本专利技术重组人胸腺素ei6作为药物在皮肤烧烫伤、碱烧伤和溃 疡的修复方面的应用。本专利技术重组人胸腺素3 16作为药物在角膜创伤修复方面的应用。 本专利技术TP化作为胸腺素家族成员之一，在促进伤口愈合的作用中 不同于市场上应用的或正在开发中的同功药物。丁(316不是生长因子， 与各种生长因子相比在治疗伤口愈合上有以下几方面优点1) 特异性地刺激上皮细胞移动，促进上皮细胞角化；2) 特异性地刺激内皮细胞移动，促进血管形成；3) 分子量很小，只有45个氨基酸(生长因子属大分子蛋白)， 易在组织内扩散；4) 结构相对简单，功能明确、特异，副作用小，可局部反复应用；5) 多肽药物易于从多途径吸收，因此给药途径可多样(如喷雾、 透皮吸收等)，作用持续时间长，可减少用药次数；6) 胸腺素(316能直接作用于细胞骨架系统，具有支持细胞结构稳 定性的作用。7) T(34还与毛囊的发育有着密切关系，可促进毛囊干细胞的迁 移、分化和胞外基质的重建，从而调节正常小鼠和大鼠的毛发生长。 因此，对胸腺素|316在创伤愈合方面的研究有重大的临床意义，其应用前景十分广阔。 附图说明图1是本专利技术融合蛋白目的基因(His-SUMO-TP 16)经PCR反应进行拼接，反应示意图；图2是本专利技术融合蛋白目的基因(GST-TP 16)经PCR反应进 行拼接，反应示意图；图3是本专利技术兔角膜细胞培养基阴性对照组；图4是本专利技术兔角膜细胞16实验组；图5是本专利技术兔角膜细胞bFGF阳性对照组；图6是本专利技术重组胸腺素3 16促进家兔烫伤皮肤愈合第一天对昭.、、，图7是本专利技术重组胸腺素e 16促进家兔烫伤皮肤愈合第九天对照；图8是本专利技术重组胸腺素e 16促进家兔烫伤皮肤愈合第十五天 对照；图6、图7、图8中A是TP16凝胶0.5 ug/克；B是TPl6 凝胶5 ug/克；C是T 0 16凝胶25 ug/克；D是T 凝胶100 ug/ 克；E是TP 16凝胶1 ug/克；F是TP 16凝胶10ug/克；G是TP 16凝胶50ug/克；H是T P 16凝胶200 ug/克；J是凝胶基质阴性对照； M是bFGF凝胶5 ug/ml;图9是本专利技术重组胸腺素P 16促进家兔碱烧伤皮肤愈合第一天 对照；图10是本专利技术重组胸腺素0 16促进家兔碱烧伤皮肤愈合第九天 对照；图11是本专利技术重组胸腺素P 16促进家兔碱烧伤皮肤愈合第十五 天对照；图9、图10、图11中Al是0.5ug/克TP 16; Bl是1 ug/克T P 16; Cl是2ug/克TP 16; Dl是3ug/克e 16; El是4ug/克TP 16; Fl是5 ug/克16; Gl是10 ug/克TP 16; Jl是基质阴性对照； Ml是5ug/克bFGF阳性对照；M2是bFGF复方阳性对照；图12是本专利技术原核表达DNA测序结果。具体实施例方式本专利技术的特点之一是利用SUMO作为高效表达重组蛋白的融合 标签。即提供一种SUMO基因和T(316的基因形成融合蛋白，并且 SUMO连接在丁(316基因的氨基端，构建了具有高表达量的融合蛋白 (SUMO-T(316)。采用原核表达SUMO-T(B化融合蛋白，再用SUMO 蛋白酶酶切后得到重组胸腺素(316单体，重组胸腺素P^单体与天然 胸腺素(316序列一致，有望为广大患者提供优质价廉的药品。SUMO是泛素类蛋白家族的重要成员之一。SUMO首先以一种 无活性的前体存在，通过SUMO酶即ULPs/SUSPs催化，特异地识 别SUMO前体-COOH端保守的G-G序列水解产生。利用SUMO 作为高效表达重组蛋白的融合标签具有如下优势(1)抗蛋白酶解。 在细胞内，蛋白酶解受到严密调控，通过降解空闲或错误折叠的蛋白 维持细胞的稳定性。宿主表达的重组蛋白很容易被当成空闲蛋白被酶解从而降低表达水平。SUMO融合表达时，可提高融合蛋白稳定性， 促使重组蛋白胞内区域化，降低对酶解的敏感性。(2)增加重组蛋白表达量。蛋白表达的过程通常依赖于mRNA的稳定性、转录效率、 转录调控等，SUMO作为融合标签修饰并融合表达蛋白，尤其是低分 子量蛋白时，可提高融合蛋白的分子量，使其表达量明显增加。(3) 促进蛋白正确折叠。￡.//表达系统由于缺乏蛋白折叠机制，很多蛋 本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组人胸腺素β１６的氨基酸序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１。
【技术特征摘要】
1、重组人胸腺素β16的氨基酸序列SEQ ID NO1。2、 sumo融合重组胸腺素ei6的氨基酸序列SEQ ID NO: 2。3、 重组人胸腺素ei6的原核表达制备方法，其特征在于利用 SUMO作为高效表达重组蛋白的融合标签，构建pET/SUMO- T(316 大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素P 16。4、 重组人胸腺素P16的原核表达制备方法，其特征在于利用 GST作为表达重组蛋白的融合标签，构建了 pGEX-T^6大肠杆菌原 核表达体系制备重组人胸腺素P 16。5、 重组人胸腺素ei6的原核表达制备方法，其特征在于利用 pTW-TP16融合蛋白基因在大肠杆菌表达出CBD-inteinl-T ...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱迅，冯秀萍，杜柏榕，马威，
申请(专利权)人：长春博泰医药生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。