胸腺素α原的新用途制造技术

本发明专利技术公开了胸腺素α原的新用途。本发明专利技术发明专利技术人的实验证实，ＰｒｏＴα能够显著改善动物对多肽疫苗的反应性，可以用作多肽疫苗免疫原性增强佐剂。胸腺素α原可以使乙型肝炎疫苗等各种多肽疫苗免疫原性得到增强，具有广谱性，在多肽疫苗的生产和应用中意义重大。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胸腺素α原的新用途，特别是涉及胸腺素α原在作为多肽疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。
技术介绍
胸腺素α原(Prothymosinα，ProTα)是由109～113个氨基酸残基组成的小分子蛋白。ProTα分子氨基酸残基总数的约50％为酸性氨基酸残基，且成簇分布于ProTα分子的中部，使分子具有很强的亲水性。ProTα分子中不含有分泌信号，而含有由两部分组成的核定位信号，主要分布在核内，与细胞增殖功能有关，血清中仅含有少量ProTα(约占全血ProTα的10％)。大鼠ProTα由111个氨基酸残基组成，人ProTα由110个氨基酸残基组成。人淋巴母细胞(PHA激活的淋巴细胞)膜表面存在着两类ProTα受体，说明ProTα具有免疫调节作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供胸腺素α原的一种新用途。本专利技术所提供的胸腺素α原的新用途是胸腺素α原在作为多肽疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。本专利技术专利技术人的实验证实，胸腺素α原能够显著改善动物对多肽疫苗的反应性，可以用作多肽疫苗免疫原性增强佐剂。在实际应用中，胸腺素α原的来源是广泛的，可以是人源的，也可以是鼠源的，还可以是其它动物来源的；优选为人源的。所述胸腺素α原可人工合成，也可通过将胸腺素α原的编码基因插入表达载体中，体外表达获得胸腺素α原。所述人胸腺素α原具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。序列表中的序列2由110个氨基酸残基组成。所述人胸腺素α原的编码基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。序列表中的序列1由333个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自序列1的5′端第1位至333位脱氧核苷酸。在实际应用中，胸腺素α原可与多肽疫苗联合注射，当然，在制备疫苗时，也不排除添加其它药学上可接受的辅料及载体。胸腺素α原可以使多种多肽疫苗免疫原性得到增强，乙肝疫苗、疟疾多肽疫苗均得到证实，具有广谱性，是一种不可多得的多肽疫苗免疫原性增强佐剂，在多肽疫苗的生产和应用中意义重大。附图说明图1为人胸腺素α原工程菌表达人胸腺素α原的电泳图谱图2为三批中试纯化的人胸腺素α原纯度分析电泳图谱图3为人胸腺素α原HPLC纯度分析4为小鼠抗体滴度变化曲线图5为小鼠阳转率变化曲线具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、人胸腺素α原对乙肝疫苗免疫原性的增强作用1、含有人胸腺素α原基因的重组质粒pThα的构建和蛋白纯化将体外培养的人胚胎胸腺细胞(取自四月龄胎儿胸腺，制备成单个细胞，悬浮于RPMI1640培养液中，密度为1×107/ml)经20μg/ml PHA和500U/ml IL-2共刺激，37℃，5％CO2条件下培养24小时，提取其总RNA，按照宝生物公司提供的方法合成cDNA第1条链，并用其作为模板进行PCR扩增。其中，PCR扩增的引物为上游引物5′CGGAATTCATGTCAGACGCAGCCGTAG3′(带下划线的碱基为EcoRI识别位点)和5′CGGGATCCTTAGGTCATCCTCGTCGGTC3′(带下划线的碱基为BamHI识别位点)；PCR反应总体积为25μL，包括1μL(50ng)cDNA，50μmol/L dNTP，1μmol/L引物，1U rTaq酶及缓冲液(1×)。PCR反应程序为先95℃预变性5min；然后95℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；最后72℃，10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，结果扩增出一条大约330bp带。将此条带回收，克隆到pGEM-T载体上，进行测序分析。序列分析表明该序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，编码序列表中序列2的人胸腺素α原氨基酸序列。该PCR扩增产物经限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切后，克隆入载体pBV220(购自中国医学科学院病毒研究所)，得到含有人胸腺素α原基因的重组表达载体pThα。pThα转化DH5α大肠杆菌，经筛选鉴定获得高效表达的工程菌株，将该重组工程菌株经30L发酵罐培养，使用肉汤培养基，于30℃培养增菌4小时后，用42℃热诱导1、3、5小时离心取菌体，破碎菌体分离上清液，将该上清液进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图1所示，表明工程菌诱导1、3或5小时均表达出10KD的人胸腺素α原。图1中，泳道1为分子量标准；泳道2为诱导前的工程菌；泳道3，4，5分别为诱导1，3，5小时的工程菌。将三批次的诱导3小时的工程菌菌体破碎后，将离心分离得到的上清液进行DEAE离子交换层析后再进行POROS50R1反向层析。其中，DEAE离子交换层析采用的层析柱是Phamacia公司的Sepharose DEAE FF层析柱，用20mmol/LHAc-NaAc(pH4.0)与1mol/L NaCl，20mmol/L HAc-NaAc(pH4.0)进行梯度洗脱。收集洗脱峰再进行反向层析，反向层析采用的层析柱是Perseptive Biosystem公司的POROS50R1反向层析柱，其中，B泵为平衡液，C泵为4％乙醇，20mmol/LTris-HCl pH7.0，D泵为20％乙醇，20mmol/LTris-HCl pH7.0，用C和D进行梯度洗脱。将纯化得到的蛋白质溶液进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图2所示，得到电泳纯的人胸腺素α原。图2中，泳道1为分子量标准，泳道2、3、4分别为三批次的人胸腺素α原。将纯化得到的人胸腺素α原进行HPLC分析，HPLC分析结果如图2所示，保留时间为13.88的峰为人胸腺素α原，计算得知获得的人胸腺素α原的纯度为99％。2、免疫小鼠小鼠BALB/C，雌性，4-6周龄(19-21g)。重组乙型肝炎疫苗(rHBsAg)购自北京天坛生物制品有限公司。利用步骤1制备的纯度为99％的人胸腺素α原免疫BALB/C小鼠。40只BALB/C小鼠分为4组，每组10只。各组的免疫剂量如下(1)胸腺素α原组(proTα)，1μgproTα/只；(2)乙型肝炎疫苗组(rHBsAg)，0.5μg rHBsAg/只；(3)低剂量佐剂组0.5μg rHBsAg+1μg proTα/只；(4)高剂量佐剂组0.5μg rHBsAg+2μg proTα/只。在小鼠麻醉状态下(75mg/kg sodium pentobarbital IP)，在小鼠的两后肢的股四头肌肉各注射100ul样品。共免疫两次，初次免疫后，在第14天加强免疫一次。初次免疫后，每隔2周，取血检测抗HBsAg抗体产生的滴度。结果如图4所示，表明低剂量胸腺素α原具有显著的佐剂作用，显著增强小鼠的HBsAb滴度，与不加胸腺素α原佐剂的乙型肝炎疫苗组(rHBsAg)相比，差异显著(p＜0.05)。高剂量胸腺素α原亦具有佐剂作用，增强小鼠的HBsAb(抗HBsAg抗体)滴度，与不加胸腺素α原佐剂的乙型肝炎疫苗组(rHBsAg)相比，差异不显著(p＞0.05)。图4中，rHBsAg为乙型肝炎疫苗组，proTα为胸腺素α原组，rHBsAg+proTα(1μg)为低剂量佐剂组，rHBsAg+proTα(2μg)为高剂量佐剂组。初次免疫后，每隔2周，取血检测抗HBsAg抗体的阳性率(抗HBsAg抗体的滴度≥1100为阳性)。结果如图5所示，表明含有人胸腺素α原佐剂的第3组(低剂量佐剂组)初次免疫后2周的HBsAb阳性率本文档来自技高网...

【技术保护点】
胸腺素α原作为多肽疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.胸腺素α原作为多肽疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述胸腺素α原为人胸腺素α原。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述多肽疫苗为乙型肝炎多...

【专利技术属性】
技术研发人员：马清钧，张艳红，靳彦文，曹诚，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]