体外细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及体外培养细胞的方法，该方法包括：１）获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织；２）将细胞生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂，按该细胞生长调节剂总重量计算，含有０．０１重量％－２０重量％的甾醇化合物、０．００１重量％－２重量％的黄芩甙和１重量％－２０重量％的蜂蜡；３）在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外培养细胞的方法。本专利技术涉及一种组织生理修复和器官功能性再生的组合物，更具体而言，涉及一种组合物，它能够通过诱导体内原位多能性再生干细胞，使之增殖，实现哺乳动物和/或人体组织的生理性修复和再生具有完全功能的人体器官。本专利技术还涉及该组合物的使用方法和/或其他用途。
技术介绍
大规模生产细胞培养物和生物材料方面的技术进步，使组织工程学行业正在加速地发展，这些产品均是在体外，即动物或人体的体外产生或合成，然后移植到宿主身上，达到组织修复或其它治疗的目的。现代组织工程学的方法之一是将一种合成的材料移植进人体，作为结构性支架，支撑组织的生长。例如，Etex公司(该公司位于美国马里兰州剑桥)生产的α-BSM合成骨替代物可以应用于整形外科、牙科和颅面。α-BSM是一种极小的水晶状钙磷酸盐，它模仿骨骼中矿组合物含量的组成成份和结构。当这种材料与盐混合时，变为糊状，可注射进入空隙中，也可植入体内，用作可塑性的油灰。一旦这种材料置入适当位置，体温的升高会使之变硬。结果，植入物成了一个支架，最终被吸收，由新的骨组织替代。组织工程学的另一种方法是利用与合成物相反的生物基体，为受损或患病组织的修复和再生提供基础。取新鲜的人体尸体皮肤，通过一定的控制手段，即，除去皮肤以及真皮上的细胞，但不改变细胞外基质和基底膜复合体，可制成非细胞皮肤基体。为弥补人体尸体皮肤的匮乏，采用同样的方法，也可用新鲜的动物，如猪皮肤制成非细胞真皮基质。最近LifeCell公司(位于新泽西州Branchburg)专利技术了用化学方法处理人体皮肤，生产出人体皮肤基质。通过这种化学方法，可以去除所有的皮肤细胞，但保留生物活性和结构性皮肤基质。有人认为，这样一种结构性、生物化学性完好无损的非细胞基质可以提供一种信息的立体式结构排列，在一个正常的再生反应中指导血管再形成和恢复。非细胞人皮肤基质可用作同种异体移植物，即从捐赠者而不是宿主本人身体获得的移植物。将基质在液氮中冷冻，然后破裂成100个微米小粒，这些直径很小的非细胞血管移植物可发育为冠状动脉分流程序中自体移植血管的替代物。皮肤的创面愈合代表了组织工程学的一个主要目标。皮肤创面的修复涉及了炎性细胞、血管细胞、结缔细胞、组织和上皮细胞的定期平衡活性。大面积或深度创面的传统疗法采用了所谓的干燥疗法，即，使创面置于一个温暖干燥的环境中结痂。目前所用的方法用临时的敷料覆盖创面，进行局部治疗，包括使用抗生素(如SD-Ag磺胺嘧啶银)。附属专利技术，如外科清创，通常用于去除焦痂或已死亡的组织。对于烧伤创面，切线式切除部分或全层创面的外科方法尽管存在着一些缺陷，如在大面积创面中造成失血，却仍在广泛应用。采用此种方法时，先将创床准备好，随后用自体移植皮或临时敷料覆盖创面，以促进愈合。自体移植皮取自于宿主，用作病人自身创面的永久性覆盖物。由于移植皮来自于病人本身，又植回到病人自身，可以避免与免疫相关的问题。移植皮可取自于病人身上相邻的未损伤部位，在质地、颜色和厚度上力求相近。对于小面积创面，通过网孔仪器，扩张自体移植皮的面积，可使愈后皮肤达到很好的质量。但是，过多的网眼通常导致愈后皮肤易于被感染，且呈筐条状，在外形上不美观。研究人员还开发了一些替代方法，如Meek岛移植皮或三明治移植皮，它比网眼皮肤更容易处理，使自体皮大大扩展。但是，自体移植方法在治疗大面积创面病人时面临着不少的困难和限制。人们意识到，在治疗深度烧伤或大面积创面时，利用病人的自体皮供皮区无法使创面快速地完全封闭。在这样的病人身上很难再找到适合的健康皮肤供皮区，从同一供皮区取皮存在时间限制，通常在同一区域再次取皮需要等上几个星期，为的是等供皮区的愈合。这样，“主”创面，即原来需要治疗的创面就会延误愈合，增加了出现并发症的危险。更严重的是，采集自体皮实际上是在正常的健康皮肤上产生了第二次创面，增加了感染的危险和体液/电解质的失衡。此外，从同一供皮区重复取皮会导致外形缺陷或形成疤痕，因而造成病人容貌畸形。为了找到以上所述的自体同源分层移植皮的替代物，人们利用复合自体同源一同种异体的皮肤置换法开发了两步走程序。这种移植皮由皮肤异体皮(除去了表皮，用作病人的真皮替代物)和用病人自身的角质细胞在体外重组的自体表皮组成。这种自体表皮通常在体外组建，方法由Rheinwald和Green创立。这种技术方法是用胰岛素和嗜热菌蛋白酶消融一小块健康皮肤活组织，以便从表皮的基底层中分离出角质细胞，通过在体外培养自体角质细胞，可获得大量细胞，生成足够多的表皮，用于移植。这种两步走的方法有不少限制，第一，在实验室生长培养表皮层至少需要3周，这将会延误创面覆盖。为了获得治疗成功，在整个表皮层生产和创床的移植过程中均要求具备非常尖端的实验室以及训练有素的医生。在缺乏这些条件的实验室和人力资源的地区，如战场和发展中国家的乡村地区，这种限制显得尤为突出。第二，这种重建的表皮层需要移植到一个干净的创床上，因为它们对细菌感染和残存的杀菌剂非常敏感。因此，正确准备创床对于这些脆弱的表皮层的存活至关重要。更值得注意的是，尽管表皮层可以依附在真皮上，但相对于天然皮肤而言，这两层的连接是人工的。由于表皮下的真皮室的再生是一个冗长的过程，因此至少在三年内皮肤很脆弱，且经常出现水泡。此外，愈合皮肤的外观不如分层皮片移植的效果好。为了给培养的表皮层提供皮肤结构，促进移植皮的存活，同种异体皮被用来覆盖创面。清创后，将同种尸体异体皮覆盖于创面，切除异种表皮，保留创面上的异体真皮。然后，在切除了表皮的尸体异体皮上移植培养的表皮层。尸体异体皮是无生命的，因此其抗原性大大降低。为了克服由于培养自体表皮层的时间长而耽搁移植的相关问题，在临床和实验中对异体培养表皮层进行了试验。遗憾的是，尽管异体皮不含Langerhans细胞，小鼠身上进行的移植约两周后还是出现了排斥反应。异种移植皮，即，其它动物的组织，也可用来覆盖大面积创面。猪的皮肤由于与人皮肤最接近，因而是最常用的异种移植皮来源。消毒(即离子放射)以及冷冻—干燥方法可以降低猪移植皮的抗原性，以及增加抑制细菌生长的能力。异种移植皮最常用作II度烧伤的临时覆盖物，特别是用在早期切痂后。为了利于培养的表皮皮片移植后能够存活，以及预防异种组织的排斥，研究人员研制了人造真皮基质用以覆盖创面。它们可用来促进大面积切除全厚皮层创面的覆盖、控制体液丢失和预防感染。这样的人造真皮基质包括1)由尼龙或polyglactic酸网眼组成的合成网眼，成纤维细胞可在上面进行培养；2)由成纤维细胞和牛胶原混合而成的胶原胶冻；以冻干的胶原基质为基础的胶原海绵，成纤维细胞可在上面培养和迁移；胶原膜；以胶原基质为基础在体外重建的类皮肤产品。异种皮移植方法在创面临床治疗上有一些局限性，尤其是在免疫原性和生物相容性方面。移植宿主与器官异种移植产生反应的自然抗体水平与所用的异种动物的动物种类史距离成正比增加。在器官移植中，这些抗体的出现导致过急性排斥(一般发生在血管再形成后的几分钟和几小时内)，以及移植组织的丢失。为了提供大量的角质细胞在体外重建自体或异种表皮层，人们投入了大量的精力进行人体角质干细胞的培养。形成表皮基底层的角质细胞具有增殖能力，因此它们有规律地经过有丝分裂、分化和向上移本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个体外培养细胞的方法，该方法包括：获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织　；将溶于油脂中的细胞生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂，按该细胞生长调节剂总重量计算，含有０．０１重量％－２０重量％的甾醇化合物、０．００１重量％－２重量％的黄芩甙和１重量％－２０重量％的蜂蜡；在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐荣祥，
申请(专利权)人：徐荣祥，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]