潜能再生细胞及其培养方法技术

本发明专利技术涉及一种能够连续增殖的潜能再生细胞及其在体外培养和复制形成的哺乳动物包括人的细胞、组织和组织器官，本发明专利技术还涉及培养哺乳动物包括人的该潜能再生细胞、组织、组织器官的方法和培养用的细胞生长调节剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及哺乳动物包括人细胞及其细胞培养方法，具体讲，涉及一种潜能再生细胞及其在体外培养和复制形成的哺乳动物包括人的细胞、组织和组织器官，本专利技术还涉及体外培养哺乳动物包括人的细胞、组织、组织器官的方法和培养用的细胞生长调节剂。
技术介绍
世界生命科学自19世纪中叶，由于发现了遗传物质，生命科学家们均集中于细胞内遗传物质的生物化学研究，继而形成了系统的细胞分子生物学研究，但在二十世纪，经过数十年的研究狂热后，现在进入理性的发展研究阶段；20世纪终末的1998年，科学家们又想起了细胞学的研究，重新研究人体的胚胎发育，将胚胎发育的过程，用干细胞的名称来表述，并设想将用胚胎的干细胞可在体外培养成人体的各个脏器器官，而后再用这些器官进行自体移植治疗疾病；同时也设想，用胚胎干细胞进行细胞疗法，将胚胎干细胞注射在人体的发病部位，让干细胞在局部再生一个器官，最终实现对疾病的治疗。但人们的美好愿望，由于目前的科学研究进度，尚没有突破，均被现有技术中的“体外干细胞培养技术”所困饶，由于在体外没有能够培养成活干细胞，所以无法实现这一美好的愿望。现有技术中，通常意义上的细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无节制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。细胞培养的环境要求细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。因此，培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。另外，细胞培养的温度是维持培养细胞旺盛生长的另一条件，培养时要求有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。气体也是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养pH6.8时最适。细胞培养液pH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止pH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值。再者，细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖、增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。(1)合成培养基合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用时细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。(2)天然培养基使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。常见使用浓度最为5-20％。体外培养细胞根据它们在培养器皿中是否能贴附于支持物上的生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，如羊水细胞为贴附型细胞，常见的贴附型细胞是成纤维型细胞、上皮型细胞生长和游走型细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。1、成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维型细胞。本型细胞因形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。2、上皮型细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连呈单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。3、游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。常见于羊水细胞培养的早期。培养细胞形态分析培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒和空泡等，表明细胞代谢不良。现有技术中对外周血淋巴细胞培养时，正常情况下人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞。另外，组织培养细胞染色体制备时，组织细胞用于遗传学分析最常见的是体外培养的细胞株，多为恶性肿瘤细胞株，且呈贴壁生长，仅少数细胞株为悬浮生长。培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和染色体标本制出清晰度高等优点。组织细胞染色体制备的关键是掌握好体外细胞的生长动态，只有处在对数生长期的细胞才能出现较高的分裂相，所以秋水仙素处理的时机及量是染色体标本形态及分裂指数的关键。由此可见，现有技术中，仅仅是对获得的细胞进行培养，得到与原细胞相同的细胞或者细胞群。未见有报道在体外培养成体细胞具有较强持续增殖能力并能形成新的组织或组织器官的培养技术。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足之处，本专利技术的目的在于提供一种通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够连续增殖的哺乳动物包括人潜能再生细胞，其特征在于，所述的细胞具有干细胞增殖潜能、以普通组织细胞形态存在于组织中，该细胞在体外培养形成增殖状态的细胞；也形成组织和具有功能的器官；该潜能再生细胞经以下方法获得：　　　　获取哺乳动物包括人的成体细胞和／或组织，或者原位的组织和／或细胞；　　　　将所述的哺乳动物包括人的成体细胞和／或组织，或者原位的组织和／或细胞接种在培养基中培养，使潜能再生细胞激活；　　　　培养激活的潜能再生细胞，使其持续增殖并具有干细胞特性；　　　　增殖后的细胞连接，形成与潜能再生细胞原位相同的组织；　　　　继续培养形成的组织，使其成为具有生理功能的组织器官；　　　　其中，在培养基中加入一种细胞生长调节剂，该细胞生长调节剂至少含有溶解在油脂中的甾醇。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：徐荣祥，
申请(专利权)人：徐荣祥，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]