新的半乳凝素9突变体蛋白质及其用途制造技术

以大肠杆菌作为宿主生产的重组体半乳凝素９表明通过对肿瘤细胞的直接作用（诱导肿瘤细胞的细胞间粘附与凋亡的活性）和借助于免疫系的作用，具有抑制癌的转移和诱导萎缩，而且对非活化淋巴细胞没有作用，诱导活化Ｔ细胞、特别是成为过剩免疫反应原因的ＣＤ４阳性Ｔ细胞的凋亡，以及对与风湿病中关节的变形等有关的滑膜细胞具有很强的诱导凋亡能力，重组体半乳凝素９由于连接两个ＣＲＤ的连接区对蛋白水解酶的敏感性提高，所以非常容易被酶消化，丧失上述活性，为了进一步研究需要更稳定型的分子。通过改变连接半乳凝素９的两个ＣＲＤ的连接区，可得到避免对上述活性造成恶影响，而且稳定性提高的改变分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及到新型半乳凝素9突变体(突变体)蛋白质及其用途。本专利技术特别涉及到连接区域被改变的半乳凝素9以及利用该半乳凝素9的生物化学、临床检查、医疗以及药物应用技术。
技术介绍
特定的糖链和与之结合的蛋白质表现出在哺乳动物的生物体内伴随生理现象以及进化·成长的现象，以及在各种各样疾病等中起到多种多样作用和功能的证据正在被人们发现。人们发现在生物体中存在着特异识别带有β-半乳糖苷结构的糖链的动物凝集素，作为这样的凝集素类的半乳凝素，目前至少有14种基因被鉴定。半乳凝素家族根据其结构分为三个亚类、即原型(prototype)、嵌合型(chimera)、以及串联重复型(tandem repeat)、它们在生物体内的功能几乎不清楚。特别是有关具有两个糖链识别结构域的串联重复型半乳凝素，由于研究的历史短，作为它的靶的生物体内糖链(受体)还不清楚，所以其功能没有阐明。可是，根据对识别细胞表面的复杂的糖链的蛋白质进行探索发现等的经过，预想半乳凝素具有与细胞的粘附、细胞间的信息传递、细胞的活化等有关的功能，而引人注目。另外除了这样的功能之外，预想还具有其它重要的各种各样功能的那样的研究成果也正在获得。作为串联重复型半乳凝素之一的半乳凝素9在人中，最初是作为霍奇金病患者的自身抗原(autoantigen)被鉴定的(非专利文献1和2)，人们想像它是否在免疫细胞间的相互作用中起着重要的作用。小鼠的半乳凝素9可以通过使用以被认为在半乳凝素类的糖链识别结构域中保守性高的序列为基础设计的简并引物的5′-RACE PCR，从小鼠肾脏的cDNA文库克隆(非专利文献3)。人们发现用抗原刺激的人T细胞在体内和体外产生作为嗜酸性细胞趋化因子的ecalectin，而且该ecalectin与目前已知的其它嗜酸性细胞趋化因子类虽然结构上不同，但也可以归属于半乳凝素家族，具有对带有β-半乳糖苷结构的糖链的结合亲和性。从来自于人T细胞的白血病细胞株得到的mRNA成功地克隆了ecalectin，结果确认ecalectin是半乳凝素9的变异体之一，半乳凝素9与ecalectin是同一物质(非专利文献4)。作为野生型半乳凝素9，现在已报告了L型半乳凝素9(galectin-9long isoform or long type galectin-9Gal-9L)、M型半乳凝素9(galectin-9 medium isoform or medium type galectin-9Gal-9M)以及S型半乳凝素9(galectin-9 short isoform or short typegalectin-9Gal-9S)。无论那一种半乳凝素9都由两个糖链识别部位(糖识别结构域，carbohydrate recognition domainCRD)和连接两个部位的连接肽区构成，已知L型半乳凝素9含有最长的连接肽区，通过该连接肽区，N端结构域(NCRD)和C端结构域(CCRD)被连接在一起，而S型半乳凝素9含有最短的连接肽区，M型半乳凝素9含有介于两者之间长度的连接肽区，发现通常存在于比前二者更广的生物体内组织或细胞中。另外在由人细胞或组织克隆的半乳凝素9基因之间也可以看到表示遗传多态现象的存在的证据。野生型半乳凝素9由二个糖识别部位(CRD)和连接两个部位的连接区构成，以大肠杆菌作为宿主生产的重组体半乳凝素9表明通过对肿瘤细胞的直接作用(诱导肿瘤细胞的细胞间粘附和凋亡的活性)和借助于免疫系统的作用，抑制癌转移和诱导萎缩。另外半乳凝素9不作用于非活化淋巴细胞，而诱导活化T细胞、特别是诱导成为过度免疫反应原因的CD4阳性T细胞的凋亡也已阐明。另外也阐明了对与风湿病中关节变形等有关的滑膜细胞具有很强的诱导凋亡能力。非专利文献1Sahin，U.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，11810-11813(1995) 非专利文献2Tureci，O.et al.，J.Biol.Chem.，272(10)，6416-6422(1997)非专利文献3Wada，J.et al.，J.Biol.Chem.，272(9)，6078-6086(1997)非专利文献4Matsumoto，R.et al.，J.Biol.Chem.，273(27)，16976-16984(1998)
技术实现思路
通过利用这样的半乳凝素9的多方面的作用，预期可治疗癌、难治的自身免疫疾患(包括风湿病)、变态性疾患等。然而重组体半乳凝素9由于连接两个CRD的连接区对蛋白水解酶敏感性高，非常容易被酶消化，丧失上述活性。本专利技术者等进行了专心研究，结果通过对一方面保持半乳凝素9具有的糖链识别活性，一方面对蛋白水解酶表现出更稳定的分子结构进行探索，改变半乳凝素9的连接两个CRD的连接区，成功地获得了避免对上述那样的活性带来坏影响，稳定性提高的改变分子，完成了本专利技术。本专利技术提供以下内容。(1)蛋白质或其盐，其特征是半乳凝素9或与其具有基本上同等活性的蛋白质的连接肽或其附近的区域被改变。(2)上述(1)所述的蛋白质或其盐，其特征是由在半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，与半乳凝素9比较，至少对于连接肽的分解敏感性被改变。(3)上述(1)或(2)所述的蛋白质或其盐，其特征是基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质与半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70％以上同源性。(4)上述(1)～(3)中任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是(1)具有半乳凝素9的N末端侧的糖链识别区域(NCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽与(2)具有半乳凝素9的C末端侧的糖链识别区域(CCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽借助于(3)在半乳凝素9的连接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽连接。(5)上述(1)～(4)任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是(1)具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或与它具有基本上同等活性，且具有与序列3所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～8个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽和(2)具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或与它具有基本上同等活性，且具有与序列4所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～21个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽借助于(3)在序列7～9中任一个序列表示的氨基酸序列中缺失(但是，序列7中的1～32以及1～44的缺失、和序列8中1～12的缺失除外)、取代或添加1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽连接。(6)一种核酸，其特征是具有编码上述(1)～(5)任一项所述的蛋白质的碱基序列。(7)上述(6)所述的核酸，其特征是聚核苷酸。(8)上述(6)或(7)所述的核酸，其特征是DNA或RNA。(9)一种重组载体，其特征是含有上述(6)～(8)任一项所述的核酸。(10)上述(9)所述的重组载体，其特征是除了含有上述(6)～(8)任一项所述的核酸外，还含有编码标记蛋白质和/或肽的碱基序本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质或其盐，其特征是半乳凝素９或基本上具有与半乳凝素９同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域被改变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：西望，平岛光臣，山内清明，伊藤爱子，
申请(专利权)人：株式会社嘉尔药物，
类型：发明
国别省市：JP[日本]