从MCF-7提取乳凝集素功能肽及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种乳凝集素功能肽及其乳凝集素功能肽制备方法。本发明专利技术从ＭＣＦ－７乳腺癌细胞株中提取总ＲＮＡ，应用ＲＴ－ＰＣＲ技术合成模板ｃＤＮＡ，制备出人乳凝集素功能肽的基因产物。本发明专利技术首次利用蛋白质工程的手段得到目的蛋白质；利用所采用方法得到的目的蛋白质具有可重复提取、足量、纯度高、无毒性、保留抗原性的特点；为目的蛋白质的进一步研究和应用提供了质与量的保证。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，可应用于抗轮状病毒感染、调节婴幼儿胃肠道免疫功能及肠上皮细胞功能成熟，以及应用于婴幼儿保健领域。
技术介绍
大量的流行病学调查显示，全世界轮状病毒感染是引起儿童腹泻的最主要病因。在发展中国家每年约有870,000个5岁以下儿童死于该病，占5岁以下儿童腹泻病死亡人数的25％，占所有病因死亡人数的6％。其中轮状病毒GroupA是在人类流行最广的一型，估计每年由GroupA引起的死亡人数约800,000。经调查我国每年5岁以下小儿腹泻病患病达2.5亿次，初步统计表明至少有10万儿童死于轮状病毒感染腹泻。但目前尚无特效的抗轮状病毒药物。由此可见，轮状病毒腹泻造成了重大的社会和经济影响。1997年WHO正式将发展轮状病毒疫苗列为首要的疫苗发展目标。目前已列为侯选疫苗包括有减毒人轮状病毒疫苗(human rotavirus vaccinHRV)Wa株、M37、MCN13等株，但它们的保护性作用不稳定，如Wa疫苗在费城的保护率为76％，在辛辛那提的保护率为100％，而在中国上海的保护率为49.6％。最近发展的四价重配株疫苗(rhesus rotavirus RRV-TV)虽然有可靠的安全性但保护性在不同国家仍有较大波动。尽管美国已将该疫苗试用计划接种，但昂贵的价格阻碍了其在发展中国家的应用。近来母乳的研究在抗轮状病毒感染方面有了新的进展，研究发现在发展中国家和发达国家，母乳喂养儿中腹泻病发病率较人工喂养儿低，尽管也有一些研究表明腹泻病的发病率在两者中相似，但可以肯定母乳喂养儿轮状病毒感染后症状轻于人工喂养儿。通过亲和层析纯化得出乳凝集素(Lactadherin)是母乳中与轮状病毒交联最强和抗病毒特异性最高的成分，而配方乳中不含Lactadherin，因此对Lactadherin的进一步研究将有望为抗轮状病毒感染提供新的思路。Lactadherin是一种N端糖基化的46KD大小具有免疫原性的糖蛋白，由364个氨基酸组成，含有表皮生长因子(EGF)样结构的Arg-Gly-Asp(RGD)N端，能与αVβ3整合素(αVβ3-integrin)交联。Hamosh检测了母乳中Lactadherin的含量约为93±10mg/ml，以初乳中含量较多，但对Lactadherin的生理功能目前了解尚少。在不同种系的研究中发现，Lactadherin的结构域在人、鼠和牛中序列相当保守，所以大量的动物乳汁和人工合成的Lactadherin为我们的研究提供了足够的资源。轮状病毒中VP4(由gene4编码蛋白)是病毒的粘附蛋白，是病毒复制和产生免疫原性的基础，在唾液酸存在下Lactadherin能与病毒交联从而抑制病毒复制、缓解腹泻症状。有研究显示母乳喂养婴儿即使在未出现轮状病毒感染症状时仍可以检测到抗轮状病毒抗体，提示与轮状病毒交联，阻止病毒复制并不是Lactadherin抗轮状病毒的唯一机制。已知食物和微生物抗原刺激后，肠道相关淋巴组织中的肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes，IEL)增殖并在肠上皮层形成活性T淋巴细胞集落，被激活的工EL具有(1)溶细胞活性；(2)通过分泌细胞因子而产生辅助活性；(3)刺激上皮间细胞更新；(4)对食物过敏原耐受的作用等，从而保护肠道并激发其他淋巴组织产生进一步反应。有研究表明乳腺和血管内皮细胞及淋巴细胞上有αVβ3-integrin，Lactadherin能与之交联并促进这些细胞的增殖，但Lactadherin对淋巴细胞及内皮细胞的所产生的作用和随后引发的肠道保护性免疫作用的确切机制目前尚不清楚。我们已知Lactadherin在胃的任何PH值下均有活性并且结构不被蛋白酶等破坏，保证了Lactadherin以完整的结构和功能到达肠道。我们大胆假设(1)Lactadherin或Lactaherin与轮状病毒交联后能刺激肠上皮T淋巴细胞增殖并产生细胞因子进而引发一系列液免疫反应；(2)轮状病毒感染时肠道绒毛膜上皮细胞随着病毒的大量复制脱落，加速了分泌层细胞的上移，这些尚处于分泌状态的不成熟上皮细胞加重了水、电解质的紊乱。有报道指出母乳特别是初乳通过调节肠道上皮的基因表达促进肠上皮细胞的发育，因此我们将从另一方面探讨Lactadherin加快肠道上皮细胞成熟，替代受损上皮细胞在抗轮状病毒中所发挥的作用。通过对Lactadherin调节GALT功能和肠上皮细胞成熟作用的研究，来探讨其抗轮状病毒感染的可能机制，为临床开发和利用Lactadherin治疗轮状病毒感染性腹泻提供重要的理论依据。现有技术是利用柱层析和亲和层析法直接从牛乳中提取目的蛋白质乳凝集素。本法具体是通过收集大量新鲜的(挤出4小时内)未经任何处理的牛乳，根据牛乳中脂肪球膜中的蛋白质分子量的不同，进行层析分离，再利用亲和层析纯化等方法提取得到目的蛋白质。现有技术有以下不足或缺点原料来源得到大量采集后4小时之内的新鲜未经处理的牛乳困难。样本质控不同来源的牛乳其质量控制困难。样本得率利用亲和层析方法分离目的蛋白质过程繁琐、耗时(约1周)、产量低(0.35ug/ml)、不可控因素多。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提出一种从MCF-7提取的乳凝集素功能肽以及制备方法，它(1)不需要必须保证新鲜未经任何处理的牛乳，仅需保存重组的DNA即可反复获得新鲜有活性的蛋白质，解决了原材料来源困难问题；(2)得到一种具有可重复提取、足量、纯度高、无毒性、保留抗原性的目的蛋白质。本专利技术的目的是通过以下技术方法来实现的本专利技术方法包括目的基因乳凝集素功能肽的制备，表达质粒的构建，其中质粒选自pET-28a、pET-28b，目的蛋白乳凝集素功能肽的纯化检测等。目的基因乳凝集素功能肽的制备首先是从MCF-7乳腺癌细胞株中提取总RNA，应用RT-PCR技术合成cDNA模板，制备出乳凝集素功能肽的基因产物。在得到乳凝集素功能肽基因PCR产物后，可以将该基因用于原核系统表达以获得所需要的目的蛋白，原核表达系统用的最为广泛和最为成热的是大肠杆菌表达系统，用于该系统的表达质粒的构建首先是将PCR制备的目的基因经琼脂糖凝胶电泳分离，QIAGEN公司的胶回收片段柱纯化后，取100ng与50ng pET-28a(+)进行连接，于16℃连接过夜.取5uL连接液转化入50uL DH5αtm library efficiency chemically competent cells，转化细胞经42℃热休克50秒，37℃(震荡培养1h后涂于卡那霉素平板，37℃培养过夜.挑取单菌落提取质粒，进行酶切鉴定和基因的DNA序列测定，测定结果完全正确后再将阳性质粒转化入BL-21感受态细胞，检测表达。BL21/pET-28a(+)乳凝集素功能肽克隆37℃培养过夜，隔日用LBbroth培养基稀释10倍，继续培养3小时，用ITPG诱导表达4～12小时，收集细菌提取蛋白质，利用Triton X-100及超声方法破细胞膜及包涵体膜，加入蛋白酶抑制剂，保护目的蛋白。经超速离心得到上清后，利用特异性镍螯合的亲和层析柱(Ni-chelating colum)，通过不同浓度的结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液，洗脱得到纯化的目的蛋白。纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳凝集素功能肽，其特征在于它由下列方法制得：（１）从ＭＣＦ－７乳腺癌细胞中提取总ＲＮＡ；（２）设计乳凝集素功能肽ＰＣＲ引物核苷酸序列制成乳凝集素功能肽基因；　（３）构建乳凝集素功能肽重组质粒；（４）重组质 粒转化；（５）乳凝集素功能肽表达；（６）乳凝集素功能肽纯化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何振娟，裴新红，吴圣楣，朱建幸，杨凌云，
申请(专利权)人：上海第二医科大学附属新华医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]