选择具有确定分化能力的干细胞克隆制造技术

公开了生成细胞克隆群的方法，所述方法包括a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态；b)将所述克隆群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和c)选择一个或多个细胞克隆群，所选细胞克隆群确定能分化成对任一神经细胞类型、肝细胞、或心肌细胞至少约50%同质的群体。还公开了由本发明专利技术方法生成的细胞克隆群，和治疗对象中疾病的方法，所述方法包括将本发明专利技术的克隆细胞给予对象。还列出筛选测试化合物的方法，所述方法包括将测试化合物接触本发明专利技术方法生成的细胞克隆群。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】选择具有确定分化能力的干细胞克隆
技术介绍
本申请要求2009年12月2日提交的美国专利申请第61/266，072号的优先权，其全文通过引用具体纳入本文而无放弃声明。1.
本专利技术一般涉及干细胞选择、干细胞分化和细胞治疗的领域。更具体地，本专利技术涉及选择具有确定分化能力的非遗传修饰克隆多能干细胞系的方法，和由本专利技术方法所生成干细胞克隆的应用。2.相关领域描述包括胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞在内的多能干细胞为研究早期发育、疾病建模和毒理学以及细胞治疗应用带来极大希望。成体和胚胎神经干细胞也如此。由于这种细胞可在培养中增殖并维持其分化成不同细胞类型的潜能，它们可提供几乎不受限制的细胞供给用于治疗各种疾病。一个活跃的研究领域是用细胞疗法治疗神经系统疾病和心血管病。治疗神经系统退行性疾病的一种方法是将中枢神经系统的细胞如多巴胺能神经元移植到神经系统的受影响区域。用于细胞治疗的潜在细胞源通过体外分化ES细胞、诱导多能干(iPS)细胞和其它类型干细胞来制备。就人、恒河猴和狨猴ES细胞描述了制备灵长类ES细胞培养物的方法(美国专利号 5，843，780; 6, 200，806; 7, 029，913)。不幸的是，尽管易通过培养获得衍生自多能干细胞的不同细胞类型异质混合物，但其靶向分化成特定谱系仍是难题。一般，培养中的ES细胞分化产生细胞的异质混合物，其中仅一些可能是适于细胞治疗的分化细胞，如神经细胞。更受控的分化过程会有力地帮助改善来自干细胞的神经细胞和组织工程改造。因此，需要从干细胞制备分化细胞用于细胞治疗的改良方法。
技术实现思路
本专利技术部分基于对提供具有特定或具体分化潜能的多能干细胞克隆群的方法的鉴定。本专利技术的方法具有提供分化细胞的富集群体的益处，所述细胞能应用于采用ESC的细胞治疗或生物技术。另外，在治疗性应用中采用纯化或高度纯化的分化细胞可减少对象中不良作用的风险，如将细胞移植入脑后畸胎瘤或神经上皮瘤的风险。此外，本专利技术的方法可提供未遗传修饰的细胞克隆群。本专利技术包括生成或产生细胞克隆群的方法，所述方法包括a)获得多能(pluripotent)或多潜能(multipotent)细胞群,所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态山)将所述群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞克隆群经确定能分化成对至少约50%均一的任一神经细胞类型、肝细胞、肌肉细胞或心肌细胞群体。在某些实施方式中，所述方法还可包括提供一个或多个选定细胞群的细胞或其后代。如以下实施例所示，某些克隆多能干细胞系中的肝细胞典型标记物在向拟胚体分化期间增加约100倍。“细胞克隆群”在本文中定义为指源自单个共同祖先细胞的细胞组。术语“多能干细胞”指能使细胞产生所有3个胚层即内胚层、中胚层和外胚层的细胞。尽管在理论上多能细胞可分化成任何机体细胞，实验测定多能性通常是基于多能细胞分化成各胚层中的数种细胞类型。在本专利技术的一些实施方式中，多能干细胞是从囊胚的内细胞团衍生的胚胎干(ES)细胞。在其它实施方式中，所述多能干细胞是通过分化细胞重编程衍生的诱导多能干细胞。在某些实施方式中，所述多能干细胞是通过体细胞核移植衍生的胚胎干细胞。所述多能干细胞可以是人胚胎干细胞。人胚胎干细胞的非限制性示例包括 Hl、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BGOI、BG02、BG03、HSFl、HSF6、Hl、H7、H9、Hl3B 和H14。多能细胞可以是如下更详细讨论的诱导多能细胞(iPSC)。iPSC的非限制性示例包括 iPS6. I、iPS 6. 6、iPS、iPS 5. 6、iPS 5. 12、iPS 5. 2. 15、iPS 5. 2. 24、iPS 5. 2. 20、iPS6.2. I和iPS 5/3-4. 3。所述方法还包括扩增所选细胞克隆群。所述方法还包括确定细胞 是否能分化成对任一神经细胞、肝细胞或心肌细胞至少约50%同质的群体。所述方法还包括提供所选细胞克隆群。所述方法还包括制备用于储存或运输的选定细胞克隆群。所述制备用于储存或运输的细胞可包括冷冻细胞。术语“多潜能干细胞”指能分化成有限数量组织类型的干细胞。多潜能干细胞的非限制性示例包括神经干细胞和造血干细胞。“神经干细胞”是来自神经组织的未分化细胞，能产生更多的神经干细胞(即显示自我更新)和最终将分化成神经细胞的后代细胞。神经干细胞可以是成体或胚胎神经干细胞。本文所用的术语“心肌细胞”指(a)显示已知存在于成熟或未成熟心肌细胞中的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟或未成熟心肌细胞中的一种或多种标记物或其它蛋白的细胞。因此，本文所用的术语“心肌细胞”指成熟或未成熟心肌细胞。形态特征的非限制性示例包括形成跳动肌肉细胞，表达心特异性肌节蛋白，表达离子通道。标记物的非限制性示例包括心肌肌钙蛋白I (cTnl)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2. 5、N-钙粘蛋白、β I-肾上腺受体(β I-AR)、ANF、MEF-2 转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白和心钠素(Li等，2006)。本文所用的“神经细胞”指显示(a)显示已知存在于成熟神经元、未成熟神经元、成熟胶质细胞、未成熟胶质细胞或神经祖细胞的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟神经元、未成熟神经元、成熟胶质细胞、未成熟胶质细胞或神经祖细胞的一种或多种标记物、神经递质或其它蛋白的细胞。形态特征的非限制性示例包括小细胞体、树突和轴突样多重突起。标记物、神经递质或其它蛋白的非限制性示例包括a)神经元特征性的β 3-微管蛋白、微管相关蛋白2(ΜΑΡ-2)或神经丝；b)星状细胞中存在的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) ；c)少突细胞特征性的2’，3’ -环核苷酸3’ -磷酸二酯酶(CNPase)、半乳糖脑苷脂(GaIC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP) ；d)未分化ES细胞特征性的0ct_4 ；e)神经前体和其它细胞特征性的Pax-6和巢蛋白；f)发育中的中枢神经系统特征性的Sox I ；g)存在于儿茶酚胺神经元中的酪氨酸羟化酶(TH) ；h)存在于含Y-氨基丁酸的神经元中的谷氨酸脱羧酶同种型67(GAD67) ；i)中间神经分化特征性的波形蛋白；和j)多巴胺分泌、放射性多巴胺摄取和多巴胺转运体表达，其是多巴胺能分化的特征。“胶质细胞”的非限制性示例包括星状细胞、少突细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、施万(Schwann)细胞和卫星细胞。本文所用的“神经细胞”包括“神经元细胞”。本文所用的“神经元细胞”指成熟或未成熟神经元。例如，成熟或未成熟神经元可以是成熟或未成熟多巴胺能神经元。本文所用的术语“肝细胞”指(a)显示已知存在于成熟或未成熟肝细胞中的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟或未成熟肝细胞中的一种或多种标记物或其它蛋白的细胞。因此，本文所用的术语“肝细胞”指成熟或未成熟肝细胞。形态特征的非限制性示例包括嗜酸性胞质，大量线粒体和嗜碱性点彩，具有分散染色质和显著核仁的圆核。还可通过鉴定包括甲胎蛋白、白蛋白在内的肝特异性蛋白表达来识别肝细胞。可用于区分肝细胞的其他方法包括电子显微镜、免疫细胞化学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·普雷纳特西奥弗，K·克劳斯，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：