本发明专利技术涉及一种从植物中分离得到的核糖体失活蛋白（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎａｃｔｉｂａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＲＩＰＳ）中国商陆蛋白，它通过催化原核和真核生物核糖体表面高度保守具有茎环结构ｒＲＮＡ脱嘌呤，起到抗ＡＩＤＳ作用。本发明专利技术涉及一种Ｔａｔ蛋白，它的碱性氨基酸富集域为蛋白传导结构域（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，ＰＴＤ），可以携带许多外源蛋白直接进入细胞内，作为细胞因子或毒素蛋白的导向。本发明专利技术涉及一种Ｔａｔ和中国商陆抗病毒蛋白突变体的融合蛋白。我们运用Ｑｕｉｃｋ－ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ定点突变技术，对ＣＡＰ进行缺失突变：Ｎ端缺失２２个氨基酸，Ｃ端缺失２９个氨基酸，定点突变：１５１ＫＩ１５２／１５１ＡＡ１５２；１９１ＦＮ１９２／１９１ＡＡ１９２。本发明专利技术研究的重组蛋白体外具有抗ＨＩＶ－１的生物学活性，发现融合基因中ＣＡＰ的缺失和定点突变，可明显降低其对ｒＲＮＡ的结合能力（即细胞毒性），但不影响其结合ＨＩＶ ＲＮＡ的能力（即抗ＨＩＶ活性），更具临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及两个与艾滋病病毒相关的基因/蛋白，中国商陆抗病毒蛋白的基因及其编码蛋白(CAP)突变体及人免疫缺陷病毒HIV-1基因编码的一个反式作用激活因子(TAT)基因及其编码的蛋白，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白的开发与应用领域。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征(AIDS，艾滋病)由人免疫缺陷病毒(HIV)引起。自该病毒/疾病发现二十年来，其在世纪范围内的传播十分迅猛，严重威胁着人类的健康和社会的发展。1985年6月23日北京协和医院发现首例HIV患者以来，我国爱滋病的流行近几年来呈加速上升趋势。据估计，我国爱滋病病毒感染实际人数已超过60万人。作为艾滋病预防主要手段之一的HIV疫苗的研制经过众多科学家的潜心研究，已经取得了重大进展，但由于HIV基因组的高度变异给疫苗的研制带来了极大的困难。疫苗的研制尚存在众多的技术问题，因而作为治疗使用的抗AIDS药物研究就显得特别重要。目前，临床使用的抗AIDS药物多为化学合成物，如3’叠氮胸腺嘧啶脱氧核酸AZT(azidodeoxy-thumidine)，是逆转录酶的一种抑制剂，它是第一个被美国FDA批准的用于AIDS治疗的抗病毒药物，其毒副作用较大，易产生耐药性。因此有必要用新的思路来研究新的治疗手段或发现新的安全有效的抗HIV-1的药物来对付日益严重的AIDS病的蔓延。从植物中分离得到的一类核糖体失活蛋白(Ribosome inactibating proteins，RIPS)的抗AIDS活性近年来备受众多科学家所关注，它通过催化原核和真核生物核糖体表面高度保守具有茎环结构rRNA脱嘌呤，发挥广谱的抗病毒作用，其研究取得了突破性进展。本专利技术研究通过系列突变，定点突变策略筛查能增强中国商陆与HIV RNA结合，但弱化中国商陆与rRNA结合的氨基酸，提高了中国商陆抗病毒的活性，降低了其毒性。Tat蛋白是人免疫缺陷病毒HIV-1基因编码的一个反式作用激活因子，Tat蛋白的碱性氨基酸富集域为蛋白传导结构域(protein transduction domain，PTD)，它可以携带许多外源蛋白直接进入细胞内，目前可于同细胞因子或毒素等蛋白偶联，作为细胞因子或毒素蛋白的导向。本专利技术研究构建了Tat-CAP的重组体，并完成了重组体中CAP的N末端22个氨基酸，C末端29个氨基酸的缺失突变，CAP定点突变151KI152/151AA152和191FN192/191AA192，有可能明显降低其对rRNA的结合能力(即细胞毒性)但不影响其结合HIV RNA的能力(即抗HIV活性)，更具临床应用前景。
技术实现思路
1.克隆中国商陆抗病毒蛋白基因，表达其编码蛋白，并获得其突变体缺失突变CAP的N末端22个氨基酸，C末端29个氨基酸，CAP定点突变151KI152/151AA152和191FN192/191AA192；克隆Tat的cDNA长258bp，同时将上述Tat cDNA与突变后的中国商陆抗病毒基因串联。2.CAP同源模建，体外模拟正常与突变CAP蛋白的高级结构进一步分析Tat-CAP重组蛋白氨基酸改变造成的活性改变与PAP蛋白高级结构变化间的可能关系。并通过与已有的PAP/rRNA、HIV rRNA复合物分子模型的比较，确定其结合位点处的RNA碱基及CAP氨基酸的特征。3.Tat-CAP突变体的融合蛋白在原核中的高效表达及有效分离纯化，制备重组蛋白多克隆抗体。4.测定比较重组蛋白体外抗HIV-1的生物学活性，最终将上述基因/蛋白应用于AIDS的治疗。本专利技术应用基因组信息学原理、RT-PCR、PCR突变、分子克隆、DNA序列测定、蛋白表达与分离、纯化，重组蛋白抗HIV-1的生物学活性技术等，克隆鉴定编码人免疫缺陷病毒反式作用激活因子(Tat)编码基因，及中国商陆抗病毒蛋白基因，获得中国商陆的突变体，在原核表达系统表达Tat和中国商陆抗病毒蛋白突变体的融合蛋白，通过测定其生物学活性，为上述蛋白应用于AIDS的治疗打下基础。本专利技术的主要技术特征在于1.CAP是从植物中分离得到的一类核糖体失活蛋白，具有抗AIDS活性，用PCV1为模板，获得Tat的cDNA基因片段。2.Tat及CAP突变体的串联。3.Tat-CAP突变体融合蛋白在原核中的高效表达及有效分离，纯化，复性。4.分离纯化上述重组蛋白；并制备重组蛋白多克隆抗体。5.重组蛋白体外抗HIV-1良好的生物学活性，表明上述基因及其编码蛋白，可用于AIDS的基因治疗及重组药物的开发。附图说明图1中国商陆蛋白与美洲商陆蛋白同源模建图2缺失突变CAP的N末端22个氨基酸，C末端29个氨基酸。运用Quick-mutagenesis定点突变技术，Tat-CAP融合基因中的CAP定点突变151KI152/151AA152和191FN192/191AA192A图Tat-CAP 151KI152/151AA152突变的测序结果B图Tat-CAP 191FN192/191AA192突变的测序结果图3Tat-CAP突变体的原核表达及分离纯化；A图Tat-CAP 151KI152/151AA152突变体的原核表达及分离纯化泳道1.蛋白质Marker，由上至下依次为分子量97、66、43、31千道尔顿的条带。泳道2 pET-21a(+)-Tat-CAP 151KI152/151AA152质粒转化的宿主菌诱导前表达的蛋白泳道3 pET-21a(+)-Tat-CAP 151KI152/151AA152质粒转化的宿主菌诱导后表达的蛋白泳道4.pET-21a(+)-Tat-CAP 151KI152/151AA152质粒转化的宿主菌诱导后样品上清泳道5.pET-21a(+)-Tat-CAP 151KI152/151AA152质粒转化的宿主菌诱导后样品包涵体泳道6 pET-21a(+)-Tat-CAP 151KI152/151AA152质粒转化的宿主菌诱导后溶解的包涵体泳道7 pET-21a(+)-Tat-CAP 151KI152/151AA152质粒转化的宿主菌诱导后复性的包涵体泳道8，9是经分子筛纯化后的目的蛋白B图Tat-CAP 191FN192/191AA192突变体的原核表达及分离纯化泳道1.蛋白质Marker，由上至下依次为分子量97、66、43、31千道尔顿的条带。泳道2 pET-21a(+)-Tat-CAP 191FN192/191AA192质粒转化的宿主菌诱导前表达的蛋白泳道3 pET-21a(+)-Tat-CAP 191FN192/191AA192质粒转化的宿主菌诱导后表达的蛋白泳道4.pET-21a(+)-Tat-CAP 191FN192/191AA192质粒转化的宿主菌诱导后样品上清泳道5.pET-21a(+)-Tat-CAP 191FN192/191AA192质粒转化的宿主菌诱导后包涵体样品泳道6-7 pET-21a(+)-Tat-CAP 191FN192/191AA192质粒转化的宿主菌诱导后包涵体，用5％的Triton X-100 A液洗涤泳道8，9 pET-21a(+)-Tat-CAP 191FN192/191AA192质粒转化的宿主菌诱导后包涵体用2M尿素洗涤泳道10经分子筛纯化后的目的蛋白图4重组蛋白的理化指标的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种克隆的中国商陆抗病毒蛋白基因，并获得的突变体：Ｎ端缺失２２个氨基酸，Ｃ端缺失２９个氨基酸，定点突变：１５１ＫＩ１５２／１５１ＡＡ１５２；１９１ＦＮ１９１／１９１ＡＡ１９１。一种将ＴａｔｃＤＮＡ与突变后的中国商陆抗病毒基因串联的重组体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温见燕，阴彬，王先平，文中伟，樊峥，彭小忠，袁建刚，强伯勤，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。