一株离子注入诱变选育的高效微生物絮凝剂产生菌制造技术

目前所使用的絮凝剂存在着各种局限性，限制了其广泛的开发应用，生物絮凝剂作为一类新型絮凝剂，其广谱的絮凝活性、可生物降解性及应用安全性，显示了它在水处理、食品加工和发酵工业等方面的应用前景。因此，筛选高效新型絮凝剂产生菌对其应用做出很大的贡献。重离子和传统的物理诱变源相比具有许多独特的特性，利用它可能使一些其他方法很难取得诱变效果的工业微生物发生有经济意义的突变，为工业微生物诱变育种开辟一条新的途径。同理，此种方法也可以应用于环境微生物工程中，提高微生物絮凝剂的生产能力，目前将重离子诱变微生物应用于环境工程中的研究微乎其微，可以说我们的发明专利技术可以为此领域的研究提供一些重要的基础。

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种新兴的交叉学科-离子注入育种技术筛选得到絮凝效果提高显著的高效絮凝菌。絮凝技术是提高水处理效率的一种既经济又简便的处置处理方法，絮凝效果的好坏往往决定后续流程的运行状况、最终出水水质和费用，在絮凝处理过程中，絮凝剂的种类、性质、品种直接影响到处理效果，因此絮凝剂是絮凝法处理水的核心。
技术介绍
随着工业和科学技术的发展，无机和有机合成高分子絮凝剂越来越广泛地被应用于各种水源水和废水的处理过程中。但是，在其使用的过程中，人们逐渐认识到传统絮凝剂的不安全性和造成环境二次污染染的问题。过量的无机离子不仅影响产品的风味、口感，腐蚀生产输送设备，也不利于人体健康。比如铝系絮凝剂的频繁使用，导致饮用水中含有过量的铝离子，或者毒害水生生物和微生物，通过食物链进入人体，摄入过量的铝离子人群中，老年性痴呆的患者比例较高。有机合成高分子絮凝剂如丙烯酰胺多聚体，虽然其本身没有任何毒性，但其难降解性却易造成二次污染，而且聚合单体丙烯酰胺的残留也是一个令人十分担忧的问题，它不仅具有强烈的神经毒性，而且是强致癌物，现在许多国家和领域已禁止或限量使用此类絮凝剂。因此，开发一种安全无毒、絮凝活性高、无二次污染的新型絮凝剂对人类的健康和环境保护都具有很重要的现实意义。微生物絮凝剂是利用生物技术，从微生物体内或分泌物中分离提取的一种安全、高效且能自然降解的特殊高分子代谢产物(次生代谢产物)。生物絮凝剂与传统的无机和有机合成高分子絮凝剂相比具有许多独特的性质和优点，如高效、无毒、无二次污染、价格较低，采用微生物絮凝剂处理废水时，其处理费用较目前的化学絮凝处理费用低，大约节约1/3的费用。20世纪50年代，人们发现了能产生絮凝作用的细菌培养液，1986年，Ryuichiro Kurane等人，采用从旱田土壤中分离出的红球菌属微生物Rhodococcus erythropolis的S-1菌株，用特定培养及培养条件，制成絮凝剂NOC-1。并且把它用于畜牧产废水处理、膨胀污泥处理、砖厂生产废水处理和废水的脱色处理，都取得了很好的处理效果，被认为是目前发现的最好的微生物絮凝剂，也是目前研究最为深入的生物絮凝剂。此后，国内外掀起了微生物絮凝剂研究的高潮，但大部分研究都集中在利用传统的分离纯化方法筛选微生物絮凝剂产生菌及絮凝特性的研究、化学本质的分析和产絮凝剂机制的研究。但是，制备高絮凝活性的微生物絮凝剂离不开菌种的筛选，筛选是最为艰难也是最为重要的步骤。目前筛选高效的微生物絮凝剂的方法有两种一是通过传统的分离纯化方法，另一种是通过诱变的方法。传统的分离纯化方法工作量大，而且由于从自然界直接分离到的野生型菌株积累产物的能力往往很低，无法满足工业生产的需要，这就要求对它们进行菌种改造。根据大量的研究报导，微生物絮凝剂的产生是由絮凝基因控制的，而诱变能够从本质上改变絮凝基因，使遗传物质核酸中的核苷酸顺序发生了稳定的可遗传的变化，从而产生絮凝率大幅度提高的可稳定遗传的突变株。目前，国内外对微生物絮凝剂产生菌进行诱变育种的研究很少，并且仅仅局限于传统的物理化学诱变，但是，由于这些诱变源的反复使用，导致其诱变新突变的能力减弱，老的诱变源诱变产量的提高已到极限，若再想使工业微生物积累大量新的突变，必须寻找新的物理诱变源。离子束生物技术是一种菌种选育新方法，它集化学诱变和物理诱变于一身，突变率高、操作简单，显现了巨大的优势，并已被生产实践证明是一种行之有效的微生物菌种选育的方法，也是一种不可替代的育种方法。目前，采用离子注入微生物诱变育种的研究工作主要集中于医学、药学、食品行业的微生物诱变育种及基因工程，该技术在环境微生物的诱变育种工作中开展的不多。
技术实现思路
本专利技术利用离子注入的方法诱变微生物絮凝剂，筛选出具有高产趋势，遗传性能稳定的高效微生物絮凝剂突变菌株C3-X。使一些其他方法很难取得诱变效果的环境微生物发生有经济意义的突变，为环境微生物诱变育种开辟一条新的途径。本专利技术优点与现有的微生物絮凝剂育种技术相比，本专利技术有以下优点1.离子注入生物体有众多新特点，注入离子的质、能、电联合作用的生物学效应比核辐射产生的生物学效应具有更丰富的内容和更宽广的诱变图谱，可能在较低的剂量下，产生很高的突变率，尤其是在存活下来的菌种中发生变异的几率是很高的；2.大幅度提高了絮凝率；3.拓宽了离子注入的应用领域。具体实施办法出发菌株C3为传统方法筛选，确定其为细菌，其絮凝率为84.2％。本专利技术实施过程所采用的模拟废水为高岭土悬浊液(200目过筛、浓度4g/L)，在其中投加一定量的絮凝剂和助凝剂(1％的CaCl2溶液)，进行絮凝试验，水力条件为200rpm快搅1min，80rpm慢搅2min，静沉5min，取距液面50％深度处液体，测定其吸光度OD550，同时以蒸馏水代替发酵液作对照。絮凝率的计算公式如下絮凝率E＝(A-B)/A×100％式中A-对照上清液550nm处的吸光度B-絮凝后清液550nm处的吸光度离子注入方法采用干胞法。于新鲜斜面取一环菌接入种子培养基(100mL/250mL三角瓶)，30℃，150r/min培养10h，取菌液1.5mL与离心管中。离心收集菌体(4000r/min，5min)，用无菌生理盐水洗涤菌体三次，加0.4mL生理盐水，制成菌体浓度约为107个/mL的单细胞菌悬液，取0.03mL均匀涂布于无菌平皿中央Φ10mm左右范围，以无菌风吹干，即制得菌膜。取镜检无细胞重叠者进行离子注入。注入剂量为1012-1014ion/cm2H+，辐照在大气中进行。筛选出的突变株菌落形态见表1，存活率-剂量曲线见附图说明图1。表1初筛结果 离子注入筛选到一株突变株C3-X，照片见图2。将其连续转接六代，絮凝率均稳定保持在98％左右，絮凝率比野生菌株C3提高了13.8％，证明通过离子照射后的菌株发生了突变而不是刺激作用，同时也表明用离子注入的方法进行微生物絮凝剂产生菌的诱变筛选是可行的，具有实际意义及工业价值。权利要求1.一种本实验室筛选保藏的絮凝剂产生菌C3及突变株C3-X。2.权力要求书1中的C3-X菌用于制备微生物絮凝剂。3.权力要求书1中的用C3菌制备微生物絮凝剂的方法，其特征是挑取纯菌落涂布至细菌平板培养基使菌落长到满视野，用打孔器打孔，接入装有150ml发酵培养基的锥形瓶中培养，在恒温振荡器中30℃，150rpm条件下培养66h，即得到絮凝剂样品。发酵培养基成分为葡萄糖30g，尿素0.3g，酵母膏0.6g，NaCl0.6g，K2HPO46g，KH2PO43g，pH＝7。4.权力要求书1中所利用的离子注入选育高效的微生物絮凝剂产生突变株C3-X的方法。全文摘要目前所使用的絮凝剂存在着各种局限性，限制了其广泛的开发应用，生物絮凝剂作为一类新型絮凝剂，其广谱的絮凝活性、可生物降解性及应用安全性，显示了它在水处理、食品加工和发酵工业等方面的应用前景。因此，筛选高效新型絮凝剂产生菌对其应用做出很大的贡献。重离子和传统的物理诱变源相比具有许多独特的特性，利用它可能使一些其他方法很难取得诱变效果的工业微生物发生有经济意义的突变，为工业微生物诱变育种开辟一条新的途径。同理，此种方法也可以应用于环境微生物工程中，提高微生物絮凝剂的生产能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种本实验室筛选保藏的絮凝剂产生菌Ｃ３及突变株Ｃ３－Ｘ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨玉楠，任娜，胡训杰，陈亚松，韩冬，汤历漫，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]