本发明专利技术公开了一种使致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，包括下述步骤：将分离获得的各虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基（ＫＰＳ）上诱发突变，打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基（ＭＭ）、氯酸盐土豆培养基（ＫＰＳ）上鉴定后获得硝酸盐利用缺陷型（ｎｉｔ）突变株；通过营养亲和性实验将亲和能力高的ｎｉｔ菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子，培养所形成的菌株作为异核体菌株；对异核体菌株的菌丝用Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８进行荧光染色后观察，确定其细胞存在异核现象（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｓｉｓ）。本方法用于生产具有相对稳定高致病力菌剂防治农业、林业和牧业的虫害。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到生物防治领域中的一种虫生真菌选育方法。
技术介绍
运用昆虫的真菌天敌研制成真菌制剂以防治虫害，是害虫生物防治的重要内容。但是始终面临着两个难以解决的问题，其中之一就是真菌菌株对害虫致病力不稳定问题。一般一个生产菌株连续3代后致病力会下降，这是由于在准性重组过程中不同基因型的核易于分离，从而出现所谓“菌种退化”，给生产应用带来很多麻烦。从理论上讲，理化诱变、异核体合成及准性重组是大多数半知菌亚门昆虫病原真菌培育高毒力菌株的三个基本途径。只是目前的一些工作表明，理化因素诱变的昆虫病原真菌的形态或营养缺陷型突变体，其毒力常常降低甚至完全丧失。在昆虫病原真菌中，不少的间接材料已说明了异核体具有比合成它的亲本菌株较高的毒力水平。在生防实践中采用人工合成异核体“制种”，是一值得探索的途径。目前仅在金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliea)等为数不多的种中通过原生质体融合实现了准性重组真正育成比亲本毒力更高的新菌种。然而，比原生质体融合手段更简便，而又不需要对亲本菌株做理化诱变的方法未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述缺点，而提供一种用于生产防治农业、林业和牧业的虫害的菌剂的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法。。本专利技术的致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，包括下述步骤(1)将分离获得的虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基(KPS)上诱发突变，打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基本培养基(MM)、氯酸盐土豆培养基(KPS)上鉴定后获得硝酸盐利用缺陷型(nit)突变株；(2)通过营养亲和性实验将亲和能力高的nit菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区的孢子，培养所形成的菌株作为异核体菌株；(3)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象(heterokaryosis)。上述的致病力相对稳定的选育方法，包括下述步骤(1)将分离获得的虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基上诱发突变；从氯酸盐土豆培养基上打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基、氯酸盐土豆培养基上鉴定；凡是氯酸盐土豆培养基上生长良好，而同时在基础培养基上菌落生长只有微弱菌丝的角变就是真正的硝酸盐利用缺陷型突变株；(2)将选出的硝酸盐利用缺陷型突变株在基础培养基上配对培养，间隔3-5cm，25℃，暗培养21天左右，观察菌株间的亲和能力。如果亲和，菌落间则形成旺盛生长的配接丛，如果不亲和，菌落间没有特殊生长的配接丛；(3)通过营养亲和性实验将亲和能力高的硝酸盐利用缺陷型突变株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子作为异核体菌株，保存在基础培养基上；(4)间隔3月重复亲和性实验，检测筛选出的亲本菌株间亲和能力的稳定性，如此重复3次，从而分离出亲和能力最稳定的亲本菌株和亲和后形成的异核体菌株；(5)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象；(6)通过在实验室进行致病试验，然后挑选出对蚜虫具有较高致病力的异核体菌株，同时明确该异核体菌株的亲本菌株；(7)最后挑选出具有较高致病力的异核体菌株，明确亲和形成该异核体菌株的亲本菌株。其中培养基配方如下氯酸盐土豆培养基(KPS)土豆200g；琼脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸馏水补1000ml。BM培养基蔗糖30g；KH2PO41g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；琼脂20g；微量元素液0.2ml；蒸馏水补足1000ml。微量元素液组分ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg；NaMO4.2H2O 50mg；水1000ml。基础培养基(MM)1000mLBM中加入NaNO33g。上述方法可应用的杀虫真菌。指可以自然侵染某种节肢动物或线虫，使某种节肢动物或线虫致病或死亡的真菌。如白僵菌属(Beauveria)、绿僵茵属(Metarhizium)、被毛孢属(Hirsutella)、拟青霉属(Paecilomyces)、轮枝霉属(Verticillium)等具有准性生殖过程的虫生真菌。因为在准性生殖过程中异核体的形成是一种必然，但是一般异核体又是很容易分解的。所以人为地选择稳定而优良的亲本配接形成异核体是很好方法。本专利技术的方法与现有技术相比，由以上技术可知，使用可以稳定地实现亲和的两个亲本菌株，亲和后形成异核体，该异核体具有两亲优良特性，用以发酵生产菌剂防治虫害。当异核体菌剂的致病力下降时，可以通过长期保存的亲本菌株重新亲和配接形成。这样达到育成具有相对稳定高致病力杀虫真菌之目的。使用该方法获得的菌株可以用于生产菌剂防治农业、林业和牧业的虫害。具体实施例方式实施例1(1)从采自全国的8个蝉拟青霉菌株上分离获得32个单孢子菌株，将分离获得的各虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基(KPS)上诱发突变；(2)从氯酸盐土豆培养基(KPS)上打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基(MM)、氯酸盐土豆培养基(KPS)上鉴定；(3)凡是氯酸盐土豆培养基(KPS)上生长良好，而同时在基础培养基(MM)上菌落生长只有微弱菌丝的角变就是真正的硝酸盐利用缺陷型(nit)突变株；(4)将选出的各个nit菌株在基础培养基(MM)上配对培养，间隔3-5cm，25℃，暗培养21天左右，观察菌株间的亲和能力。如果亲和，菌落间则形成旺盛生长的配接丛，如果不亲和，菌落间没有特殊生长的配接丛(见表1)；(5)通过营养亲和性实验将亲和能力高的nit菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区孢子作为异核体菌株，保存在基础培养基(MM)上；(6)间隔3月重复亲和性实验，检测筛选出的亲本菌株间亲和能力的稳定性，如此重复3次，从而分离出亲和能力最稳定的亲本菌株和亲和后形成的异核体菌株；(7)对异核体菌株的菌丝用Hoechest 33258进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象(heterokaryosis)；表1蝉拟青霉nit突变株间的营养亲和反应 注“+”表示营养亲和；“-”表示营养不亲和；通过以上步骤分离出的具有稳定的高亲和能力的蝉拟青霉异核体菌株有55-57、56-57、58-57，和其亲本菌株55、56、57、58。菌株的培养特性和产孢结构是在查氏培养基上25℃14天菌落直径16mm，菌丝纯白色致密毡状、粉质，具有放射状沟纹；背面纯白色有凹陷。分生孢子梗浓密地分枝，3.5μm宽，由2-5个瓶状小梗组成的轮生体。瓶状小梗基部膨大或纺锤形无明显膨大，9.6-33×3-3.6μm其上端为突然变细大约0.6μm的管状偏离主轴，分生孢子为长圆至柱形常弯曲，壁光滑，透明6-10×2.4-3.6μm.。在PDA培养基上25℃14天菌落直径64mm白色粉质，背面豆汁黄。其中培养基配方如下氯酸盐土豆培养基(KPS)土豆200g；琼脂20g；蔗糖20g；KClO320g；蒸馏水补足1000ml。BM培养基蔗糖30g；KH2PO41g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；KCl 0.5g；琼脂20g；微量元素液0.2ml；蒸馏水补足1000ml。微量元素液组分ZnSO4.7H2O 5g；CuSO4.5H2O 250mg；MnSO4.H2O 50mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种致病力相对稳定的杀虫真菌选育方法，包括下述步骤： （１）将分离获得的虫生真菌的单孢子在氯酸盐土豆培养基上诱发突变，打孔分离出抗氯酸盐角变，并在基础培养基、氯酸盐土豆培养基上鉴定后获得硝酸盐利用缺陷型突变株； （２）通过营养亲和性实验将亲和能力高的硝酸盐利用缺陷型菌株作亲本，挑取各亲本菌株亲和配接区的孢子，培养所形成的菌株作为异核体菌株； （３）对异核体菌株的菌丝用Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８进行荧光染色后观察认定其细胞存在异核现象。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱英，赵杰宏，邹晓，赵德刚，韩洁，文庭池，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：52[中国|贵州]
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