本发明专利技术公开了一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，包括液体培养基的制备、链格孢菌培养、链格孢菌毒素的制备和链格孢菌毒素的应用，将制备的活性毒素配制成浓度为125～2000μg/mL的混合液，喷洒在空心莲子草上，在3天内使空心莲子草表现出明显的毒害症状，并杀死杂草，同时对大多数空心莲子草共生杂草具有毒杀效果。本发明专利技术方法液体培养操作简单、培养基质材料易获得、所需设备简单，所用毒素稳定性强，提取纯化工艺简单，可大批量生产；助剂对毒素具有较强的增效作用，以毒素作茎叶喷施，使用方便，既可有效杀灭目标杂草空心莲子草，同时也可兼顾杀灭大多数共生杂草，具有较高的环境安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物应用于农业植物保护的
，具体是一种利用致病真菌防 治外来杂草空心莲子草的方法。
技术介绍
空心莲子草是我国广泛分布的外来入侵杂草之一，其生命力强，生长繁殖迅速，扩 散快，能够入侵多种生境，危害当地的生物多样性，造成农作物减产，影响农事作业，污染水 体，堵塞水道，影响了淡水养殖和农田灌溉，发展成为我国许多地区的恶性杂草。2003年被 列入国家环保总局公布的"中国第一批外来入侵生物名单"。空心莲子草的防治主要包括物 理防治、化学防治和生物防治。物理防治可短时间内产生较好的防除效果，但因空心莲子草 具有较强的克隆繁殖特性，只要有1个茎节其就能繁殖，因此采用常规的机械除草和翻耕 方法，只会将其切成更多的茎段，从而催生更多的新植株，不利于防除。化学防治在一定程 度上对控制空心莲子草发挥了积极作用，但一些除草剂只能杀死地上部分，而对地下部分 却没有效果，且大量化学除草剂的使用必将对环境和人类健康产生一定的负面影响。因此， 开展生物防治是目前空心莲子草防治最具潜力的和开发前景的方法。其中，利用天敌昆虫 及病原菌进行防治是目前空心莲子草生物防治的主要方法，而利用病原菌进行防治的方法 目前还处于防治物筛选阶段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，以解 决上述
技术介绍
中提出的问题。为解决上述问题，专利技术人在对空心莲子草入侵现状调查过程中发现了野外空心莲 子草的自然发病现象，对其致病真菌进行了分离鉴定研究，经过筛选，获得了强致病链格孢 菌菌株J-14 ;通过前期菌丝体、孢子及代谢产物对空心莲子草致病性比较研究，发现链格 孢菌代谢产物具有更强的致病性，同时其避免了菌丝体和孢子货架期短的问题。-种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，具体步骤如下： (1)液体培养基的制备 ①先采集新鲜的空心莲子草茎叶，冲洗干净，阴干去除茎叶表面的水分，剪碎成 1~2cm的碎片，取200g，加适量的水，煮沸后，继续煎煮22~28min，经两层纱布过滤， 得空心莲子草煎液；②添加葡萄糖20g，加水定容至1000mL;③分装至500mL三角瓶，每瓶 300mL，在0·IMPa压力下灭菌24~26min; ⑵链格孢菌培养在灭菌后的液体培养基中转接3块直径为0. 8~1. 2cm的链格孢菌饼于液体培养 基中；培养温度为25±1°(：，光照为170=12:12，摇床振荡培养，转速为110印111/1^11，培养 时间为5~7d; (3)链格孢菌毒素的制备 将培养后菌液经减压抽滤得滤液，滤液经大孔吸附树脂吸附，然后用体积浓度为 90 %的洗脱剂洗脱得洗脱液，并浓缩得棕色浸膏；浸膏经柱层析分离得活性毒素； (4)链格孢菌毒素的应用 将分离的活性毒素加入水中进行配制，配制成浓度为125~2000 μ g/mL的混合 液，并加入助剂，混合均匀后，喷洒在空心莲子草上，在3天内使空心莲子草表现出明显的 毒害症状，并杀死共生杂草，同时对大多数空心莲子草共生杂草具有毒杀效果。 作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（3)中的洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、丙酮、 乙醇中的一种或两种混合物。 作为本专利技术进一步的方案：所述步骤（4)中的助剂为表面活性剂、植物源助剂、增 效剂和渗透剂的混合物，提高链格孢菌毒素对空心莲子草3~5倍的植物毒性。 作为本专利技术再进一步的方案：所述助剂为十二烷基苯磺酸钠、曲拉通X-100、硝酸 铵、有机硅、司班-60、农乳HSH437、农乳0201B、农乳1602、农乳8205中的多种混合物。 经安全性检测发现，毒素对花生、芝麻、空心菜、大豆、丝瓜及玉米具有较强的致病 性，而对棉花和烟草的致病性较弱，相对比较安全。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是： 本专利技术方法液体培养操作简单、培养基质材料易获得、所需设备简单，所用毒素稳 定性强，提取纯化工艺简单，可大批量生产；助剂对毒素具有较强的增效作用，以毒素作茎 叶喷施，使用方便，既可有效杀灭目标杂草空心莲子草，同时也可兼顾杀灭大多数共生杂 草；可用于棉花田、烟草田及荒地等生境中空心莲子草的防除，具有较高的环境安全性。【附图说明】 图1为不同浓度链格孢菌毒素对空心莲子草的致病性对比图。 图2为不同助剂对毒素的增效作用图。 (A:吐温20;B:吐温80;C:曲拉通X-100;D:油酸甲酯；E:木质素磺酸钠；F:十二 烷基磺酸钠；G:十二烷基苯磺酸钠；Η:硝酸铵；I:硫酸铵J:有机硅；K:月桂氮酮；L:司 班-60;Μ:农乳HSH437;Ν:农乳 0201Β;0 :乳 0Ρ-10;Ρ:农乳BY-130;Q:农乳 4003;R:农乳 600;S:农乳1602;T:农乳3201;U:农乳8205,以上均购自江苏省海安石油化工厂） 图3为不同助剂配方对毒素的增效作用图。【具体实施方式】 下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本专利技术保护的范围。 实施例1将强致病菌菌株J-14直径6_菌块转接至马铃薯琼脂培养基（PDA)、空心莲子草 茎叶煎汁培养基（ADA)、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD)、1 %聚山梨酯80-玉米琼脂 培养基（TCA)、沙氏琼脂培养基（SDLA)、察氏培养基（CDA)和沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA)7 种培养基平板上，置于25土 1°C生化培养箱中黑暗培养，5d后测量菌落直径，然后用载玻片 轻轻将孢子刮下，加入适量的无菌水配制成孢子悬浮液，在显微镜下，用血球计数板法统计 孢子的产量。每处理设5个重复，结果见表1。 表1表明链格孢菌在空心莲子草茎叶煎汁培养基（ADA)和沙氏葡萄糖琼脂培养 基（SDA)上菌落生长较好，显著高于其在其它培养基上的生长（P< 0. 05)，生长5d后相应 的菌落直径分别为5. 800cm和5. 876cm;链格孢菌在沙氏琼脂培养基（SDLA)上生长的相 对较缓慢，生长5d后其菌落直径为4. 524cm。链格孢菌在ADA培养基上的产孢量最高，为 519. 374X106个，显著高于其在其它培养基上的产孢量（P< 0. 05)，其后依次为1 %聚山梨 酯80-玉米琼脂培养基（TCA)、SDA和PDA，而在SDLA上的产孢量最小，显著低于其它培养 基（P< 0. 05)。可见，ADA培养基最适合于链格孢菌的生长和产孢。 表1不同培养基对链格孢菌菌落生长和产孢的影响 表中不同小写字母表示差异显著（P< 0.05)，下同。 实施例2 用少量乙酸乙酯（浓度为2% )溶解链格孢菌毒素后，用蒸馏水分别配制125、 250、500、1000、2000μg/mL的毒素溶液。以离体叶片针刺法检测了毒素对空心莲子草的致 病性。选取无病虫害的健康空心莲子草分株，取从顶端往下数的第3对叶片，用无菌水冲洗 干净，并用吸水纸吸干叶片上的水分，置于铺有一张湿润滤纸的培养皿中，用解剖针轻轻刺 破叶片表皮，滴加10μL溶液，置于25±1°C生化培养箱中当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)液体培养基的制备①先采集新鲜的空心莲子草茎叶，冲洗干净，阴干去除茎叶表面的水分，剪碎成1～2cm的碎片，取200g，加适量的水，煮沸后，继续煎煮22～28min，经两层纱布过滤，得空心莲子草煎液；②添加葡萄糖20g，加水定容至1000mL；③分装至500mL三角瓶，每瓶300mL，在0.1MPa压力下灭菌24～26min；(2)链格孢菌培养在灭菌后的液体培养基中转接3块直径为0.8～1.2cm的链格孢菌饼于液体培养基中；培养温度为25±1℃，光照为L/D＝12:12，摇床振荡培养，转速为110rpm/min，培养时间为5～7d；(3)链格孢菌毒素的制备将培养后菌液经减压抽滤得滤液，滤液经大孔吸附树脂吸附，然后用体积浓度为90％的洗脱剂洗脱得洗脱液，并浓缩得棕色浸膏；浸膏经柱层析分离得活性毒素；(4)链格孢菌毒素的应用将分离的活性毒素加入水中进行配制，配制成浓度为125～2000μg/mL的混合液，并加入助剂，混合均匀后，喷洒在空心莲子草上，在3天内使空心莲子草表现出明显的毒害症状，并杀死共生杂草。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周兵，
申请(专利权)人：井冈山大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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