本发明专利技术涉及一种瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，该方法包括以下过程：在室温下，取斜面孢子用无菌水制成孢子悬液，取孢子悬液置于平皿中开启磁力搅拌器，置紫外灯下照射诱变，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于含有氯化锂的ＰＤＡ培养基，从中获得产素水平高于出发菌株的突变菌株，选取纯的初筛菌株转接于液体发酵培养基中选取遗传性状稳定的高产菌株。本发明专利技术的优点在于采用的诱变设备简单、方法易行、操作安全，复合诱变效果要比单一一种诱变剂的处理效果要好，依此方法诱变的到的诱变菌株，同出发菌株相比，拮抗性能提高２．５－５．０倍。
【技术实现步骤摘要】
一、
-本专利技术属于微生物诱变育种
，特别涉及一种瑞拉菌素产生菌的复 合诱变选育高产菌株方法，其采用紫外线和氯化锂复合诱变选育瑞拉菌素高产 菌株的方法，依次方法可以有效地提高瑞拉菌素的产量。二
技术介绍
自从20世纪40年代有机氯和有机汞农药问世以后，人们在与农业害虫、病害及杂草的斗争过程中，主要是依靠化学农药这一现代化武器。但是，随着 化学农药的品种和产量急增，施用范围日益扩大，农药残留污染而造成世界性 公害引起人们的忧虑。随着人类环保意识的增强，生物农药已深受人们青睐。 成为当今农药开发的热点。大多数生物农药具有选择性强、对人畜及天敌较安 全、不易产生抗性、生产工艺较简单、开发费用较低等特性。在生物农药中微 生物源农药是目前应用最广、发展最快的一类。为了保护环境和促进农业可持 续发展，开发微生物农药具有广阔的前景和深远的意义。委内瑞拉链霉菌是一种链霉菌属放线菌。其发酵产物可提取瑞拉菌素，是 一种氨基糖苷类的抗生素，对植物真菌病害有明显抑制作用，该菌株的发酵产 物对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌和番茄枯萎病菌等有强拮抗作用，大田试验证明"瑞拉菌素"对水稻稻瘟病的防治效果可达到69. 8%-95. 08%。 瑞拉菌素产生菌是一种公知的菌种，是通过对土壤中放线菌资源进行研究，采用通用的分离筛选方法分离筛选出来的。经过二十多年的研究，已在瑞拉菌 素的生物活性、理化性质、菌株鉴定、抑菌谱、发酵工艺、分离纯化、分子结 构等方面取得很大进展。但至今还未实现工业化生产，主要原因是瑞拉菌素产 生菌原始菌株的产素水平很低，产素品质较差，生产成本相对较高，从而阻碍 了瑞拉菌素的工业化进程。应用高效简便的诱变选育技术是加快瑞拉菌素的工 业化进程的关键。紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和方法简便等优点，是抗 生素产生菌选育的一种主要方法，在实验中应用得非常普遍。但采用紫外线和其 他诱变因子一起进行复合诱变选育,往往会取得更理想的诱变效果。氯化锂是无机诱变剂,做为转录阻滞剂参与蛋白质的合成，通过顺式作用元件作用于DNA ，使之形成基因增强子或者启动多拷贝基因，从而产生诱变效应。经过前处理进入细胞，与DNA分子结合，吸收紫外线的能量后，增强紫外线的诱变效果。孙嘉龙等 采用紫外线及氯化锂对产Monacolin K红曲菌株进行复合诱变，得到的正突变 菌株Monacolin K的产量比出发菌株提高3.3倍。袁琳等采用紫外线及氯化锂 对产四环素菌株进行复合诱变选育，得到的正突变菌株的活性产物产量较出发 菌株提高37%。而把紫外线及氯化锂复合式诱变法应用于瑞拉菌素产生菌的选育 方面，则未见相关专利和文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种， 利用该方法可以有效提高瑞拉菌素的产量。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的一种瑞拉菌素高产菌株的的复合诱变选育方法，其特征在于包括如下步骤:在室温下，取孢子悬液6mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，照射lmin后打开 皿盖并开启磁力搅拌器，距15W紫外灯30cm处照射诱变。然后将诱变后的孢 子悬液在红灯下系列梯度稀释到10—5和l(T涂布于含有氯化锂的高氏一号培养基 平板中，28'C避光培养7d，选取生长良好的单菌株采用双向培养法进行初筛， 初筛所得正突变菌株转接于液体发酵培养基中置于28°C， i50r/min条件下发酵 72h，对发酵液进行预处理，后采用生长速率法对初筛菌株进行复筛，以获得遗 传性状稳定的高产突变菌株。 上述工艺包括(1) 孢子悬液的制备室温下，用无菌生理盐水洗F斜面孢子并用接种环轻刮斜面表面，将菌悬 液加到盛玻璃株的无菌生理盐水中，放入摇床200r/min, 28°C，培养2h，使孢子 充分分散和活化，后用无菌脱脂棉过滤除去菌丝体，用无菌水将孢子悬液稀释 到l(T个/mL ，即制成诱变用的出发菌株孢子悬液。(2) 复合诱变处理取孢子悬液6mL置于直径9cm的带搅拌子平皿中，开启磁力搅拌器，距 15W紫外灯30cm处，照射梯度时间设不同梯度。设致死率在75%到85%的照射时 间为最佳诱变剂量。将在最佳紫外线照射时间段处理后的孢子悬液在红光下系 列梯度稀释到IO"和10—H，涂于含有氯化锂的PDA平板，其中氯化锂的浓度梯度 设为0. 1%、 0. 2%、 0. 3%、 0. 4%、 0. 5%和0. 6%，每个稀释梯度对应的每个氯化锂 浓度梯度做3个重复，将等量未处理的孢子悬液涂平板作对照，28'C避光培养 7d。(3) 初筛用打孔器制备稻瘟病菌菌饼，并将其接种在PDA平板中间，四个角点对称接待测突变株，距离PDA平板中央为3cm 。每个菌株重复五次，将接好的平皿 放置于28'C恒温箱中培养3d后，测量各突变菌株的抑菌带宽度，计算正突变 率。将筛选出来的正突变菌株移至斜面保存待复筛。(4) 发酵培养基所述液体发酵培养基的组成及含量为黄豆饼粉20g，葡萄糖10g,淀粉15g， 磷酸氢二钾O. 5g ，碳酸钙2. 5g，水定容至1L , pH8.0。(5) 摇瓶发酵培养将初筛所得的各高效正突变菌株以单菌落接种于装有10mL发酵培养液的 50mL三角瓶中，以出发菌株为对照，置于28。C， 150r/min条件下发酵72h。(6) 发酵液预处理用lmoi/L草酸凋节发酵原液的pH，边加草酸边搅拌，并用pH计测量发酵 液的pH值。至pH为3. 5，静置O. 5h后再调pH至3. 5，再静置30 min后5000 r/"in离心30 min，弃沉淀，取上清液过滤，收集滤液。(7) 复筛采用生长速率法，取不同初筛菌株的发酵预处理液lmL加入到9mLPDA屮 制备平板，同时制备lmL出发菌株的发酵预处理液加9mL PDA的平板作为对照， 在制好的平板中间接种稻瘟病菌菌饼，每种处理重复五次。2『C培养3d，最后 测定稻瘟病菌落直径，计算抑制菌丝生长的半致死浓度及相对毒力，后用诱变菌 株和出发菌株的神制效果作比较。(8) 遗传稳定性实验挑取经筛选的对稻瘟病菌有较强抑制效果的突变菌株进行传代培养，连续传7代，对每一代进行摇瓶发酵培养，收集发酵液，对发酵原液进行预处理， 采用生长速率法测其抑菌效果，从而判断遗传稳定特性。 与现有技术相比，本专利技术具有的优点和效果如下本专利技术采用紫外线和氯化锂复合诱变瑞拉菌素产生菌，采用的诱变设备简 单、方法易行、操作安全，紫外线作为一种物理诱变因子，具有诱变效果明显和 方法简便等优点，是抗生素产生菌选育的一种主要方法，在实验中应用得非常普 遍。采用紫外线和其他诱变因子一起进行复合诱变选育，往往会取得更理想的诱 变效果。氯化锂是无机诱变剂，做为转录阻滞剂参与蛋白质的合成，通过顺式作 用元件作用于DNA ，使之形成基因增强子或者启动多拷贝基因，从而产生诱变效应。本专利技术依此方法诱变的到的突变菌株RL-2-51及RL-2-76，同出发菌株相比， 拮抗性能提高2.5 5.0倍。四附图说明 图l为本专利技术的工艺流程图2为复合诱变对菌株的诱变效果； 图3为诱变后突变株菌落形态；五具体实施例方式本专利技术所釆用的菌株瑞拉菌素产生菌是一种公知的菌种，是通过对上 壤中放线菌资源进行研究，采用通用的分离筛选方法分离筛选出来的，属 于委内瑞拉链霉菌属，其发酵产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种瑞拉菌素产生菌的复合诱变选育高产菌株方法，其特征在于包括如下步骤：在室温下，取孢子悬液６ｍＬ置于直径９ｃｍ的带搅拌子平皿中，照射１ｍｉｎ后打开皿盖并开启磁力搅拌器，距１５Ｗ紫外灯３０ｃｍ处照射诱变，然后将诱变后的孢子悬液在红灯下系列梯度稀释到１０↑［－５］和１０↑［－６］涂布于含有氯化锂的ＰＤＡ培养基平板中，２８℃避光培养７ｄ，选取生长良好的单菌株采用双向培养法进行初筛，初筛所得正突变菌株转接于液体发酵培养基中置于２８℃，１５０ｒ／ｍｉｎ条件下发酵７２ｈ，对发酵液进行预处理，后采用生长速率法对初筛菌株进行复筛，以获得遗传性状稳定的高产突变菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：安德荣，苟丽霞，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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