一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法技术

一种生产Ｌ－精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产Ｌ－精氨酸的方法，涉及Ｌ－精氨酸的发酵法生产。本发明专利技术采用本实验室筛选并保藏的钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）ＳＹＡ５（组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性）为亲株，按常规方法进行物理化学诱变处理，并经多重结构类似物抗性筛选，得到突变株ＳＤＮＮ４０３（组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，Ｄ－精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性），在优化条件下培养生产Ｌ－精氨酸，产酸水平达到３０－３５ｇ／ｌ。本发明专利技术菌株具有遗传稳定性好，产量性状稳定，Ｌ－精氨酸产量保持较高的水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法，本专利技术涉及以葡萄糖、硫酸铵为主要原料，利用钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)突变株发酵生产L-精氨酸的方法。
技术介绍
L-精氨酸是人体和动物的一种半必需氨基酸，具有重要的生化和生理学意义，因此被广泛应用于食品和医药工业中，尤其在医药工业领域，其作为提高人体免疫力，防治心血管疾病以及增强男性精子活性等治疗用药已受到人们的关注。L-精氨酸的制备方法有提取法(中国专利CN1161959)和发酵法，提取法操作费时，收率低，环境污染严重，不适于大规模生产。发酵法生产L-精氨酸，有采用棒杆菌或短杆菌属的微生物，如谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌，经过诱变，筛选精氨酸结构类似物突变株，以解除精氨酸作为产物的反馈抑制和阻遏，提高L-精氨酸的产量。关于选择精氨酸结构类似物的方法，例如培养有2-噻唑基氨基丙酸抗性的L-精氨酸生产菌的方法(日本专利JP60083593)；培养有半胱氨酸或半胱氨酸类似物抗性的L-精氨酸生产菌的方法(美国专利US5034319)。上述方法采用的诱变方法及结构类似物往往比较单一，容易造成高产L-精氨酸的突变株遗传稳定性差，在大生产中产生回复突变，从而造成L-精氨酸产量性状下降。发酵法生产L-精氨酸，也有采用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌通过基因改造，导入关键酶的基因或增加关键酶的拷贝数，从而提高获得的重组菌的L-精氨酸的产量(中国专利CN1276421和美国专利US4430430)，但上述方法所获的重组菌株的外源质粒很容易在生产中丢失或者需要加入一定的选择性压力，使得采用这类重组菌来生产L-精氨酸时很难进行工艺放大，难以实现产业化。从工业化角度看，要求生产L-精氨酸的菌株遗传稳定性好，且产生的杂酸少，L-精氨酸产量达一定水平，工艺放大较为容易，这样才能适合于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法，其中包括筛选具有多重结构类似物抗性的突变株以及在适宜条件下培养该突变菌株大量生产L-精氨酸。在本专利技术中，用于筛选的出发菌株为实验室筛选的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5；用于筛选的抗性标记药物有磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸。本专利技术所述的一种生产L-精氨酸的菌株，该菌株为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SDNN403，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0890。该菌株具有以下遗传特性组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性，且磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸抗性、高精氨酸抗性、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。用于本专利技术的L-精氨酸生产菌株可以这样得到出发菌株进行多重物理、化学因子逐级诱变，并经多重结构类似物抗性筛选获得。选用紫外线，硫酸二乙酯和N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(简称亚硝基胍，下同)多次诱变处理，将诱变后的微生物涂布在含一定量磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸的基础琼脂筛选培养基上，挑出在此培养基上生长的菌落进行摇瓶筛选。突变菌株诱变谱系见附图1。该菌株的诱变方法(1)出发菌株钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)。(2)逐级诱变紫外线诱变，得诱变菌株SUV67-18(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)；硫酸二乙酯诱变，得诱变菌株SUD18-80(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性)；再经硫酸二乙酯诱变，得诱变菌株SD100-28(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性)；亚硝基胍诱变，得诱变菌株SDN28(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性)；再经亚硝基胍诱变，得诱变菌株SDNN403(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性)。(3)培养和结构类似物抗性筛选种子培养种子培养基葡萄糖30-50g/l，玉米浆10-20g/l，(NH4)2SO45-20g/l，KH2PO41-5g/l，MgSO4·7H2O 0.5-2g/l，尿素1.5-5g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。种子培养时装液量为30ml/250ml三角瓶，培养温度为30℃-35℃，摇瓶转速为90-120转/分。筛选培养筛选培养基葡萄糖10-30g/l，(NH4)2SO43-15g/l，KH2PO41-5g/l，MgSO4·7H2O 0.5-2g/l，FeSO4·7H2O 0.02-0.15g/l，MnSO4·H2O 0.02-0.15g/l，生物素30-50μg/l，硫胺素200-250μg/l，组氨酸500-1000μg/l，磺胺胍1-5mg/ml、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸各15-25mg/ml，琼脂20g/l，PH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。筛选培养条件为30℃-35℃培养1-5天。利用该菌株生产L-精氨酸的方法发酵培养基葡萄糖100～120g/l，玉米浆5～15g/l，(NH4)2SO440～60g/l，KH2PO41.0～2.0g/l，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/l，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/l，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/l，L-组氨酸0.5-1mg/l，生物素0.08-0.15mg/l，CaCO330g/l，初始PH7.0～7.2。按照本专利技术，可以用通风发酵的方式培养合适的微生物进行L-精氨酸的生产。作为培养基需要有适当的碳源、氮源、无机物及所需的痕量其它营养物质和无机盐。将菌株以10～15％(W/W)接种量转接到发酵培养基中，培养在通气条件下进行，如摇瓶培养和搅拌式发酵罐通风培养，培养温度30℃～35℃左右，摇床转速90～120转/分，培养pH6-8范围内，pH值中性左右。可选用碳酸钙、氨、无机酸碱溶液调节pH值。通常培养3～5天后，L-精氨酸在发酵液中积累。本专利技术的有益效果是采用了本实验室筛选得到的钝齿棒杆菌SYA5为亲株，按常规方法进行物理、化学诱变处理和结构类似物抗性筛选，得到突变株钝齿棒杆菌SDNN403，该突变株具有以下遗传特性组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性，且磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸抗性、高精氨酸抗性、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。在优化条件下发酵生产L-精氨酸，产酸水平达到30～35g/L。现有技术提供筛选的结构类似物多比较单一，而本专利技术提供筛选的结构类似物呈现多样性，这样就大大提高了高产L-精氨酸突变株的遗传稳定性。本专利技术菌株具有遗传稳定性好、产量性状稳定，L-精氨酸产量保持较高水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。附图说明图1为生产L-精氨酸菌株的诱变谱系图。具体实施例方式实施例1制备对磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸有抗性的突变株及发酵生产L-精氨酸。将出发菌株SYA5经紫外诱变、硫酸二乙酯诱变后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产Ｌ－精氨酸的菌株，其特征是该菌株为钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｅｎａｔｕｍ）ＳＤＮＮ４０３，Ｌ－精氨酸菌种保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．０８９０，该菌株具有以下遗传特性：组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，Ｄ－精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陶文沂，许正宏，熊筱晶，窦文芳，史劲松，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]