本发明专利技术公开了一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法。该试剂盒包括(1)、试剂1：包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒；(2)、试剂2：包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。采用本发明专利技术的试剂盒进行检测非对称二甲基精氨酸，可以容易地增强免疫浊度，放大检测信号，具有无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉的优点，可实现临床快速、大流量的样本测试，使非对称二甲基精氨酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有较高的经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于物质检验测定
，具体涉及一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法。
技术介绍
非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine，ADMA)是一种甲基化精氨酸，是内源性一氧化氮合酶(Nitric oxide sythase，NOS)抑制剂，其可竞争性抑制一氧化氮(Nitric oxide，NO)的合成。非对称二甲基精氨酸由细胞内蛋白质在精氨酸甲基转移酶作用下发生甲基化，再经水解反应所生成。许多细胞，如人的内皮细胞均可产生ADMA。正常人体内每天产生约300μmol(约60mg)，体内浓度远远高于其他同样可产生NOS抑制作用的内源性精氨酸，故被认为是最重要的NOS抑制剂。ADMA从细胞进入血液循环后，一部分被进一步分解代谢直接通过肾脏由尿液排出，但大部分(达250μmol)通过广泛分布于肾脏、肝脏和心血管系统的二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)降解。因此通过DDAH降解被认为是ADMD最为重要的代谢途径。目前国内外多项研究证实在多种疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症、心衰和中风等患者的血浆中ADMA水平呈显著性升高。因此，ADMA被公认为是一种新的心血管疾病危险因子。ADMA不仅参与心脏结构重塑，还与心脏功能异常有关，且还是肾功能和糖尿病诊断的重要指示因子。鉴于此，建立适用于临床的非对称二甲基精氨酸的测定方法有重大意义。但目前临床应用中，非对称二甲基精氨酸的测定方法主要包括高压液相色谱法和酶联免疫法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器，操作复杂，试验耗时较长，不能应用于临床大流量的自动化分析，且价格昂贵。由于上述缺陷，目前非对称二甲基精氨酸尚未成为临床检测的常规项目。目前尚未看到采用免疫比浊测定方法用于非对称二甲基精氨酸的检测试剂盒，原因在于，在常规的乳胶增强免疫比浊试剂盒方法中，若R1中加入抗ADMA单克隆抗体，在R2中加入包被ADMA-惰性蛋白偶联物的乳胶颗粒，并按照常规免疫浊测定，这种方法并不能改变单株单抗与小分子结合不能形成有效浊度的特征，这样实施操作不能完成检查。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于为了克服高压液相色谱法和酶联免疫法需要特别的测定仪器，操作复杂，试验耗时较长，不能应用于临床大流量的自动化分析，且价格昂贵；而若套用免疫比浊测定方法则非对称二甲基精氨酸的检测准确度低、抗干扰性能差的缺陷，提供了一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒及方法。采用本专利技术的试剂盒进行检测非对称二甲基精氨酸，可以容易地增强免疫浊度，放大检测信号，具有无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉的优点，可实现临床快速、大流量的样本测试，使非对称二甲基精氨酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的科学和经济价值。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：本专利技术提供了一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒，其包括：试剂1：包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒；试剂2：包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。较佳地，所述的试剂1包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂；更佳地，所述的试剂1由包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂组成。较佳地，所述的试剂2包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂；更佳地，所述的试剂2由包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂组
成。其中，所述的抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体一般可通过商业化公司获得，也可以通过将非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物免疫小鼠，制备单抗所得；所述的惰性载体较佳地包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或多种；所述的抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体更佳地为Acris Antibodies,Inc.公司的AP02005PU-N ADMA抗体。其中，所述的非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物优选是将非对称二甲基精氨酸与惰性载体通过化学交联剂进行化学交联获得；较佳地，所述的惰性载体包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或多种；较佳地，所述的化学交联剂为EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和/或Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)。其中，试剂1中，所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得：通过乳胶颗粒表面的化学基团，如羧基、氨基、巯基等，采用化学交联剂将抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体结合到乳胶颗粒表面。本专利技术中采用的化学交联方法，优选采用两步交联法，以确保悬浮缓冲液中没有残留的未结合的游离抗体，从而保证了试剂盒测定的准确性。更佳地，所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得：乳胶颗粒表面先经过EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化，然后加入抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体，此时抗体的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应，即可。最佳地，所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得：将乳胶颗粒加入到MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲溶液中，搅拌条件下加入EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，室温反应，离心除去上清液，加入含有抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的pH 8.3硼酸缓冲液，室温包被，再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液，终止反应，离心清洗，超声分散，即得。其中，试剂2中，所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得：通过乳胶颗粒表面的化学基团，如羧基、氨基、巯基等，采用化学交联剂将非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物结合到乳胶颗粒表面。本专利技术中采用的化学交联方法，优选采用两步交联法，以确保悬浮缓冲液中没有残留的未结合的游离抗原，从而保证了试剂盒测定的准确性。更佳地，所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒通过下述步骤制得：乳胶颗粒表面先经过EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化，然后加入非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物，此时偶联物的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应，即可。最佳地，所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒通过下述步骤制得：将乳胶颗粒加入到MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲溶液中，搅拌条件下加入EDAC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，室温反应，离心除去上清液，加入含有非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的pH 8.3硼酸缓冲液，室温包被，再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液，终止反应，离心清洗，超声分散，即得。其中，所述的乳胶颗粒可为试剂盒检测领域常规使用的各种乳胶颗粒，所述的乳胶颗粒较佳地选自粒径为50～500nm(更佳地为100～300nm)、表面带有一种化学交联基团(如氨基、羧基、羟本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒，其包括：试剂1：包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒；试剂2：包括包被非对称二甲基精氨酸‑惰性载体偶联物的乳胶颗粒。
【技术特征摘要】
1.一种测定非对称二甲基精氨酸浓度的试剂盒，其包括：试剂1：包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒；试剂2：包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂1包括包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂；较佳地，所述的试剂1由包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒、缓冲液、免疫凝集促进剂、稳定剂和防腐剂组成；和/或，所述的试剂2包括包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂；较佳地，所述的试剂2由包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂组成。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体为Acris Antibodies,Inc.公司的AP02005PU-N ADMA抗体；所述的非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物是将非对称二甲基精氨酸与惰性载体通过化学交联剂进行化学交联获得；所述的惰性载体包括血蓝蛋白KLH、卵清蛋白OVA和牛血清白蛋白BSA中的一种或多种；所述的化学交联剂为EDAC和/或Sulfo-NHS。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂1中，所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒通过下述步骤制得：乳胶颗粒表面先经过EDAC和Sulfo-NHS活化，然后加入抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体，抗体的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应，即得；所述的包被抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得：将乳胶颗粒加入到MES缓冲溶液中，搅拌条件下加入EDAC和Sulfo-NHS，室温反应，离心除去上清液，加入含有抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体的pH 8.3硼酸缓冲液，室温包被，再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液，终止反应，离心清洗，超声分散，即得；和/或，试剂2中，所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的
\t乳胶颗粒通过下述步骤制得：乳胶颗粒表面先经过EDAC和Sulfo-NHS活化，然后加入非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物，偶联物的氨基端与活化后的乳胶颗粒产生交联反应，即得；所述的包被非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的乳胶颗粒较佳地通过下述步骤制得：将乳胶颗粒加入到MES缓冲溶液中，搅拌条件下加入EDAC和Sulfo-NHS，室温反应，离心除去上清液，加入含有非对称二甲基精氨酸-惰性载体偶联物的pH 8.3硼酸缓冲液，室温包被，再加入含甘氨酸的pH 8.3硼酸缓冲液，终止反应，离心清洗，超声分散，即得；试剂1和试剂2中，所述的乳胶颗粒选自粒径为50～500nm、表面带有化学交联基团的聚苯乙烯核壳结构的球状聚合物；所述的乳胶颗粒较佳地为PolyMicrospheres公司的型号为CB0172E、CB0100E、CB0213E、CB0104D或CB0267D羧基微球；所述的乳胶颗粒的质量体积浓度较佳地为0.01％～0.5％，更佳地为0.05％～0.3％。5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂1和试剂2中，所述的缓冲液为3-(N-吗啉基)-丙磺酸缓冲液、3-...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：王学忠，
类型：发明
国别省市：上海;31
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