1，5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂技术

提供一种快速测定含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒。1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒，对于含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于采用辅酶I和葡萄糖脱氢酶与NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的清除酶系，清除试样中葡萄糖交叉反应产生的干扰然后采用氧化型辅酶II和1，5‑脱水葡萄糖醇‑6‑磷酸脱氢酶的测定酶系，定量测定生成的还原型辅酶II的方法。

【技术实现步骤摘要】
1，5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂
本专利技术涉及利用不同辅酶的酶学方法定量生物试样中1，5-脱水葡萄糖醇及其定量试剂和定量试剂盒。
技术介绍
1，5-脱水葡萄糖醇(简称1，5-AG)可弥补其他血糖监控指标的不足，例如空腹血糖、糖化白蛋白、糖化血红蛋白分别只能反映即时、近2～3周和近2～3个月的血糖，没有一个指标能准确反映最近3～7天的血糖变化情况，1，5-AG刚好补了这个空缺。1，5-AG水平越低，说明血糖控制越差。1，5-脱水葡萄糖醇的化学结构与葡萄糖非常相似，已知商品化定量1，5-脱水葡萄糖醇的试剂盒都必需清除试样中葡萄糖的干扰，由于生物试样中葡萄糖的含量远远大于1，5-脱水葡萄糖醇，并且1，5-脱水葡萄糖醇的含量很低，故准确定量测定1，5-脱水葡萄糖醇的含量非常困难。目前测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶学方法主要包括(1)吡喃糖氧化酶法，该方法采用葡萄糖激酶和丙酮酸激酶去除试样中葡萄糖的干扰，但葡萄糖激酶与1，5-脱水葡萄糖醇也发生作用，使测定不准确；并且该方法直接采用Trinder’s显色法，测定灵敏度低。(2)1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶法(中国专利授权公告号CN1179051C)，该方法采用二磷酸腺苷依赖型己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸果糖激酶将试样中的葡萄糖转化为果糖-1，6-二磷酸，去除葡萄糖干扰，该方法酶系复杂，定量试剂中含有6个酶和多个辅酶，以消除葡萄糖产物和二磷酸腺苷的影响，在同一试剂中难以获得针对全部工具酶的最佳反应条件，并且，磷酸葡萄糖异构酶也会发生可逆反应，使测定不准确。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种更加简便、节约的测定含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的方法，试样中的葡萄糖被完全清除，并且消除逆反应，不会干扰1，5-脱水葡萄糖醇的定量测定方法，以及采用这些方法的试剂和试剂盒。本专利技术的另一个优点是清除试样中葡萄糖的酶系与测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶系采用不同的酶系及其辅酶或类似物，从而进一步消除干扰。本专利技术的另一个优点是测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶系不受二磷酸腺苷浓度的影响，可以选用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶。该方法采用氧化型辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称NAD)，或其类似物例如氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称thio-NAD)、或氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(简称APAD)，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系(酶系1)，将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，达到实质上完全清除试样中葡萄糖干扰的目的；随之采用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶和1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，在氧化型辅酶II选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称NADP)或氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称thio-NADP)，存在下与1，5-脱水葡萄糖醇反应，对生成的还原型NADP进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。另外，本专利技术还涉及1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，其含有氧化型NAD或其类似化合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶。另外，本专利技术还涉及1，5二脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒由含有氧化型NAD或其类似化合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶的试剂组成。另外，本专利技术还涉及试样中葡萄糖的清除方法，其特征在于采用氧化型NAD或其类似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系，将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应。另外，本专利技术还涉及试样中葡萄糖的清除试剂，其特征在于该试剂含有氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶。另外，本专利技术还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于采用氧化型NAD或其类似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系，将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，采用酶反应对试样中1，5-脱水葡萄糖醇进行定量。另外，本专利技术还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，该试剂含有氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5-脱水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。另外，本专利技术还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒由氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5-脱水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。本专利技术中所指试样是有可能含有葡萄糖的任何试样，例如血液、血浆、血清、尿液等生物体试样。试样中葡萄糖的清除方法可以按照下述反应式进行：GDH：葡萄糖脱氢酶MDH：苹果酸脱氢酶NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸仅仅将葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯时，由于反应是可逆的，生成的葡萄糖酸内酯可以再转化为葡萄糖，在该反应体系中通过将NADH转化为NAD，防止了葡萄糖的再转化，试样中的葡萄糖可以完全消除。另外，氧化NADH后，也消除了NADH对后续测定的影响。上述消除葡萄糖的方法必要时在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。葡萄糖脱氢酶NAD或NADP依赖型均可以，特别优选NAD依赖型，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2～30U/mL。NAD依赖型苹果酸脱氢酶的浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2～30U/mL。两种酶都是市售商品，如东洋坊公司的NAD/NADP依赖型葡萄糖脱氢酶，积水公司的NAD依赖型葡萄糖脱氢酶，东洋坊公司的NAD依赖型苹果酸脱氢酶，Sorachim公司的NAD依赖型苹果酸脱氢酶。氧化型辅酶I选自NAD，或thio-NAD、APAD等类似物，浓度优选0.01mM～100mM，更优选0.1～50mM，特别优选1～10mM。赋活剂如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化镁、土温20、或曲拉通X-100，无机盐类的浓度优选0.001～30g/L，更优选0.01～10g/L，特别优选0.1～9g/L，表面活性剂的浓度优选0.001～10％，更优选0.01％～1％，特别优选0.1％～0.5％。通过上述反应消除葡萄糖后，即可采用由三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、氧化型辅酶II和1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，与1，5-脱水葡萄糖醇反应，对生成的还原型辅酶II进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。试样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于在葡萄糖清除酶系采用一种辅酶，在1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系采用另一种辅酶，通过不同的辅酶隔离葡萄糖清除酶系与1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系，通过对1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系辅酶的变化进行定量。/n

【技术特征摘要】
1.含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于在葡萄糖清除酶系采用一种辅酶，在1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系采用另一种辅酶，通过不同的辅酶隔离葡萄糖清除酶系与1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系，通过对1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系辅酶的变化进行定量。


2.如权利要求1所述的定量方法，其中所述葡萄糖清除酶系采用的辅酶是氧化型辅酶I选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、以及氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸。


3.如权利要求1所述的定量方法，其中所述1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系辅酶是氧化型辅酶II选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。


4.如权利要求1或3所述的定量方法，辅酶II的定量是通过NADP依赖型黄递酶和四唑盐生成的色素进行的。


5.1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂盒，其含有第1试剂和氧化型辅酶I，第2试剂和氧化型辅酶II；
第1试剂含有葡萄糖脱氢酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学忠，
申请(专利权)人：王学忠，
类型：发明
国别省市：上海;31