一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法技术

本发明专利技术提供一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，包括以下步骤：(1)蔗糖标准曲线的制作；(2)酶液的制备；(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的测定。本发明专利技术的方法能够准确的测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量。

A method for the determination of sucrose synthetase and sucrose phosphate synthetase in plants

【技术实现步骤摘要】
一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法
本专利技术涉及一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。
技术介绍
蔗糖是甜高粱茎秆糖分的主要存在形式，蔗糖在茎秆中的积累关系到甜高粱茎秆中的糖分含量和产量，而茎秆糖分积累过程与蔗糖代谢酶密不可分。植物蔗糖代谢包括蔗糖合成、运输和转化。蔗糖代谢由多种酶调控，与蔗糖代谢和积累密切相关的酶主要有蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)和转化酶(INV)。蔗糖合成的限速酶是果糖1，6-二磷酸酯酶(FBPase)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)。蔗糖降解由代谢关键酶转化酶、蔗糖合成酶等参与调节。蔗糖合成酶(SucroseSynthase，E.C.2.4.1.13)是一种可溶性酶，分子量范围为280-540，由分子量约为83KD-100KD的亚基构成的四聚体。蔗糖合成最适pH值为8.0～9.5，蔗糖裂解最适pH值为5.5～6.5。蔗糖磷酸合成酶(SucrosePhosphateSynthase，E.C.2.4.1.14)广泛存在于植物光和组织和非光和组织中，是一种可溶性酶，由分子量117KD-138KD的亚基构成，为二聚体或四聚体，是一种低丰度蛋白(不到可溶性蛋白的0.1％)，且不稳定。以不同发育时期的甜高粱和采后不同贮藏方式甜高粱茎秆为实验材料，旨在了解高粱茎秆的SS和SPS的含量变化，为甜高粱品质研究提供理论依据。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，包括以下步骤：(1)蔗糖标准曲线的制作；(2)酶液的制备；(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的测定：向试管中加入0.05M果糖溶液或F6P溶液0.1mL，UDPG0.1mL，0.1MTris溶液0.1mL，0.05mL10mMMgCl2溶液，向空白试管中加入0.1mL10％NaOH溶液，向所有待测样品试管中加入酶液0.2mL；将上述试管全部放入37℃水浴中保温30min；接着取出在沸水浴中加热1min，流水冷却；随后向样品试管中加0.1mL10％NaOH溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着将上述试管全部加入3.5mL36％HCL，85℃水浴加热10min，流水冷却；然后将上述试管全部加入0.5mL0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；接着加入4.5mL蒸馏水，摇匀；最后在480nm下比色；结果按照以下公式计算：单位为：mg·g-1·h-1其中：X：标准曲线上查得蔗糖含量(100μg/mL)V1：样品总体积(mL)V2：测定时取酶液体积(mL)m：样品质量(g)t：酶反应时间(h)。作为优选，步骤(1)中，所述蔗糖标准曲线的制作方法为：准备一系列不同浓度的蔗糖溶液，然后加入NaOH溶液，沸水浴加热，并冷却；接着加入HCL溶液，80℃水浴加热，并冷却；随后加入间苯二酚溶液，65℃水浴加热，并冷却；最后在480nm下比色，以蔗糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制蔗糖标准曲线。作为优选，步骤(2)中，所述酶液的制备方法为：在植物样品中加入磷酸缓冲液并匀浆，研磨浆液，然后将研磨好的浆液离心，取上清液。本专利技术的方法能够准确的测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为不同贮藏方式对甜高粱茎秆蔗糖合成酶活力变化的影响。图2为不同贮藏方式对甜高粱茎秆蔗糖磷酸合成酶活力变化的影响。图3是蔗糖标准曲线图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例11材料与方法1.1材料甜高粱茎杆：于玛纳斯采收。1.2试验方法甜高粱收获后除去高粱穗，秸秆分别采取整秆去叶立放、整秆去叶平放、整秆带叶立放、整秆带叶平放和金字塔型堆放等九种贮藏方式。在自然条件下贮藏，整秆型贮藏方式采取50根捆扎为一组；金字塔型堆放贮藏方式为：去叶去穗后茎秆截为20厘米长的短杆，每50个短杆捆扎为一组，堆放方式为单层(七组放一层)、双层(第一层七组，第二层六组)、三层、四层和五层(三种方式均为第一层七组，以后每层递减一组)。两个品种采样时间为：采收前选取抽穗期、成熟期、完熟期三个时期，采收后220d贮藏期间每10d取一次样，对两个品种甜高粱茎秆水份、总糖、还原糖、蔗糖、可溶性糖、总酸等指标进行测定。1.3测定方法1.3.1蔗糖合成酶活性的测定1.3.1.1蔗糖标准曲线的制作表1蔗糖标准曲线的制作按照表1中标示的量在1至6号试管中分别加入上述试剂，然后加入0.1mL10％NaOH溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着加入3.5mL36％HCL溶液，80℃水浴加热10min，流水冷却；随后加入0.5mL0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；最后在480nm下比色。以蔗糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。1.3.1.2酶液的制备称取2g样品，加10mLpH7磷酸缓冲液，用高速匀浆机匀浆；研钵中可加入少许石英砂，研磨打好的浆液；将匀好的浆液在3500r/min转速下离心10min。取出适量上清液备用。1.3.1.3蔗糖合成酶(SS)活性的测定向试管中加入0.05M果糖溶液0.1mL，UDPG0.1mL，0.1MTris溶液0.1mL，0.05mL10mMMgCl2溶液，向空白试管中加入0.1mL10％NaOH溶液，向所有待测样品试管中加入酶液0.2mL；将上述试管全部放入37℃水浴中保温30min；接着取出在沸水浴中加热1min，流水冷却；随后向样品试管中加0.1mL10％NaOH溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着将上述试管全部加入3.5mL36％HCL，85℃水浴加热10min，流水冷却；然后将上述试管全部加入0.5mL0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；接着加入4.5mL蒸馏水，摇匀；最后在480nm下比色。结果按以下公式计算：单位(mg·g-1·h-1)其中：X：标准曲线上查得蔗糖含量(100μg/mL)V1：样品总体积(mL)V2：测定时取酶液体积(mL)m：样品质量(g)t：酶反应时间(h)。1.3.2蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的测定1.3.2.1蔗糖标准曲线的制作同1.3.1.1。1.3.2.2酶液的制备同1.3.1.2。1.3.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)蔗糖标准曲线的制作；/n(2)酶液的制备；/n(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的测定：/n向试管中加入0.05M果糖溶液或F

【技术特征摘要】
1.一种测定植物中蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)蔗糖标准曲线的制作；
(2)酶液的制备；
(3)蔗糖合成酶或蔗糖磷酸合成酶活性的测定：
向试管中加入0.05M果糖溶液或F6P溶液0.1mL，UDPG0.1mL，0.1MTris溶液0.1mL，0.05mL10mMMgCl2溶液，向空白试管中加入0.1mL10％NaOH溶液，向所有待测样品试管中加入酶液0.2mL；将上述试管全部放入37℃水浴中保温30min；接着取出在沸水浴中加热1min，流水冷却；随后向样品试管中加0.1mL10％NaOH溶液，沸水浴加热10min，流水冷却；接着将上述试管全部加入3.5mL36％HCL，85℃水浴加热10min，流水冷却；然后将上述试管全部加入0.5mL0.1％间苯二酚溶液，65℃水浴加热10min，流水冷却；接着加入4.5mL蒸馏水，摇匀；最后在480nm下比色；结果按照以下公式计算：单位为...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟伊娜，傅力，张平，吴斌，郑素慧，吴忠红，张健，
申请(专利权)人：新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，韩山师范学院，
类型：发明
国别省市：新疆;65