基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途制造技术

本发明专利技术涉及用于丙二酰‑CoA检测的重组微生物，在其中III型聚酮合酶编码基因插入基因组中，或在其中引入了含有所述基因的重组载体；使用所述重组微生物筛选丙二酰‑CoA产生诱导物质的方法；筛选参与增加丙二酰‑CoA产生的基因的方法；以及一种如下方法，其包括在微生物中敲低通过所述方法筛选的基因从而增加所述微生物中丙二酰‑CoA的产生，以及使用丙二酰‑CoA作为前体在所述微生物中产生有用的物质。根据本发明专利技术的生物传感器的使用提供了单步信号生成、在各种微生物中的利用、在自荧光微生物中的利用、简单的构建方法和简单的筛选方法。另外，当本发明专利技术与高通量筛选相结合时，其优点在于可以非常容易且快速地(约3天)筛选具有增加的丙二酰‑CoA产生能力的菌株，并且所述菌株可以直接应用于有用化合物的基于丙二酰‑CoA的产生。

Novel malonyl COA biosensor based on type III polyketosynthase and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途
本专利技术涉及基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途，并且更具体地涉及用于丙二酰-CoA检测的重组微生物(其中引入了含有III型聚酮合酶编码基因的重组载体)；使用重组微生物筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法；筛选参与增加丙二酰-CoA产生的基因的方法；以及一种如下方法，其包括在微生物中敲低通过所述方法筛选的基因从而增加微生物中丙二酰-CoA的产生，以及使用丙二酰-CoA作为前体在微生物中产生有用的物质。
技术介绍
由于全球环境问题，有限资源的耗竭以及对环境友好型能源的需求增加，基于可再生生物的细胞工厂的建设越来越受到关注。这些细胞工厂可以通过针对产生所需的代谢物优化的细胞内代谢网络产生所需的代谢物(生物能、环境友好的化学物质、新药物物质等)，并且这一技术过程需要各种分子生物技术。在可通过微生物细胞工厂产生的各种物质中，丙二酰-CoA尤为重要，因为它是产生非常有用的物质如聚酮、苯丙素类和生物燃料的关键前体。然而，丙二酰-CoA在细胞中引起各种必需的代谢反应(如脂肪酸生物合成)，因此可用于代谢工程化的丙二酰-CoA的量非常小。此外，需要高性能仪器如LC-MS/MS来测量丙二酰-CoA的细胞内浓度，并且需要一种花费很长时间并要求非常小心的采样方法来测量丙二酰-CoA，所述丙二酰-CoA在细胞中快速产生后消失并且对周围环境条件敏感。因此，已经从先前研究开发了基于转录因子的丙二酰-CoA生物传感器，以更快速且更容易地测量丙二酰-CoA的细胞内浓度(XuP,LiL,ZhangF,StephanopoulosG,KoffasM(2014),ProcNatlAcadSciUSA111:11299-11304；LiS,SiT,WangM,ZhaoH(2015),ACSSynthBiol4:1308-1315)。然而，如上所述基于转录因子的基于荧光蛋白的传感器的缺点在于它们必须经历各种信号传导步骤并且不能用于自荧光微生物如假单胞菌属(Pseudomonas)。因此，本专利技术人努力解决上述问题，因此开发出一种基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器，其利用III型聚酮合酶(包括RppA)通过一步反应将丙二酰-CoA转化为有色物质的特性；并且发现生物传感器的使用可以容易地检测丙二酰-CoA，使得可以筛选产生丙二酰-CoA的菌株、丙二酰-CoA产生诱导物质和参与增加丙二酰-CoA产生的基因，以及使得可以容易地构建一种使用丙二酰-CoA作为底物或前体来产生各种有用物质的方法，从而完成本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供用于丙二酰-CoA检测的新型生物传感器和使用所述生物传感器的各种方法，以及通过使用所述方法增加所述微生物中丙二酰-CoA产生以及使用丙二酰-CoA作为底物或前体在所述微生物中产生有用物质的方法。技术方案为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于丙二酰-CoA检测的重组微生物，在其中III型聚酮合酶编码基因插入所述微生物的基因组中或在其中引入了含有III型聚酮合酶编码基因的重组载体。本专利技术还提供了筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法，其包括以下步骤：(a)培养上述重组微生物；(b)向所述重组微生物中添加候选物质；(c)将添加所述候选物质后的所述重组微生物的培养上清液的颜色与没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液的颜色进行比较；并且(d)当添加所述候选物质后所述重组微生物的培养上清液显示出比没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。本专利技术还提供了筛选参与增加的丙二酰-CoA产生的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将改变重组微生物中的基因表达的基因调节文库引入上述重组微生物中，从而构建所述重组微生物中的基因表达发生改变的重组微生物文库；(b)培养所构建的重组微生物文库和未引入基因调节文库的重组微生物，从而测量所述培养上清液的吸光度，并比较所培养上清液的颜色；并且(c)当所述重组微生物文库的培养上清液显示出比未引入所述基因调节文库的重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择引入所述重组微生物文库中的基因。本专利技术还提供了产生具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物的方法，所述方法包括调节通过上述方法筛选的基因在固有地具有丙二酰-CoA产生能力或外部引入丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达。本专利技术还提供了具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物，其中选自以下基因的一种或多种基因：fabF(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II)；yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；xapR(xapAB的转录激活因子)；cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；mqo(苹果酸脱氢酶)；yfiD(丙酮酸甲酸裂解酶亚基)；fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶)；pyrF(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)；araA(L-阿拉伯糖异构酶)；fadR(fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子)；pabA(氨基脱氧分支酸合酶，亚基II)；purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)；和hycI(参与加工HycE的C末端的蛋白酶)在具有丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达与在野生型微生物中的表达相比降低。本专利技术还提供了使用丙二酰-CoA作为底物或中间体产生有用物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)构建重组微生物，其中另外引入参与所述有用物质产生的基因或增加所述基因的表达，或者另外使参与所述有用物质产生的基因缺失或减少所述基因的表达；(b)培养所构建的微生物；并且(c)从所培养的微生物回收所述有用物质。本专利技术还提供了用于产生6-甲基水杨酸的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码6-甲基水杨酸合酶(6MSAS)和4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(Sfp)的基因，或者增加所述基因的表达。本专利技术还提供了产生6-甲基水杨酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养上述重组微生物；并且(b)从所培养的微生物回收所述6-甲基水杨酸。本专利技术还提供了用于产生芦荟酮(aloesone)的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码芦荟酮合酶的基因或增加了所述基因的表达。本专利技术还提供了产生芦荟酮的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养上述重组微生物；并且(b)从所培养的微生物回收所述芦荟酮。本专利技术还提供了用于产生白藜芦醇的重组微生物，其中在上述重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(TAL)、4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于丙二酰-CoA检测的重组微生物，在其中III型聚酮合酶编码基因插入所述微生物的基因组中，或在其中引入了含有所述III型聚酮合酶编码基因的重组载体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180608 KR 10-2018-00663231.一种用于丙二酰-CoA检测的重组微生物，在其中III型聚酮合酶编码基因插入所述微生物的基因组中，或在其中引入了含有所述III型聚酮合酶编码基因的重组载体。


2.权利要求1的重组微生物，其中所述III型聚酮合酶是：
源自选自灰色链霉菌、天蓝色链霉菌、阿维链霉菌、红色糖多孢菌、波赛链霉菌和针孢链霉菌的微生物的RppA；
源自荧光假单胞菌的PhlD(聚酮合酶)；
源自地中海拟无枝菌酸菌的DpgA(聚酮合酶)；
源自掌叶大黄的ALS(芦荟酮合酶)；或
源自木立芦荟的PCS(5,7-二羟基-2-甲基色酮合酶)、OKS(八酮合酶)、PKS3(芦荟酮合酶)、PKS4(八酮合酶2)或PKS5(八酮合酶3)。


3.权利要求1的重组微生物，其中编码所述III型聚酮合酶的基因与选自tac、trc、T7、BAD、λPR和Anderson合成启动子的启动子可操作地连接。


4.权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物选自大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、凝聚杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。


5.一种筛选丙二酰-CoA产生诱导物质的方法，其包括以下步骤：
(a)培养权利要求1的重组微生物；
(b)向所述重组微生物中添加候选物质；
(c)将添加所述候选物质后的所述重组微生物的培养上清液的颜色与没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液的颜色进行比较；并且
(d)当添加所述候选物质后所述重组微生物的培养上清液显示出比没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。


6.权利要求5的方法，其中步骤(c)中颜色之间的比较是通过肉眼进行。


7.权利要求5的方法，其中步骤(c)中颜色之间的比较是通过测量吸光度来进行，并且步骤(d)包括当添加所述候选物质后测量的吸光度高于未添加所述候选物质的情况下测量的吸光度时，选择所述候选物质作为所述丙二酰-CoA产生诱导物质。


8.一种筛选参与增加丙二酰-CoA产生的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将改变重组微生物中的基因表达的基因调节文库引入权利要求1的重组微生物中，从而构建所述重组微生物中的基因表达发生改变的重组微生物文库；
(b)培养所述构建的重组微生物文库，测量所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度，培养所述重组微生物然后将所述基因调节文库引入，并比较所述重组微生物文库的培养上清液的颜色与在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的颜色；并且
(c)当所述重组微生物文库的培养上清液显示出比在将所述基因调节文库引入之前的重组微生物的培养上清液更深的红色时，选择引入所述重组微生物文库中的基因作为参与增加丙二酰-CoA产生的基因。


9.权利要求8的方法，其中步骤(b)中颜色之间的比较是通过肉眼进行。


10.权利要求8的方法，其中步骤(b)中的颜色之间的比较是通过测量吸光度来进行，并且步骤(c)包括当所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度高于在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的吸光度时，选择在所述重组微生物文库中引入的基因。


11.权利要求8的方法，其中所述基因调节文库是选自以下的文库：sRNA文库、基因组文库、cDNA文库、gRNA文库和用于构建敲除或突变菌株的寡核苷酸文库。


12.一种产生具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物的方法，所述方法包括调节通过权利要求8至11中任一项的方法筛选的基因在具有丙二酰-CoA产生能力的微生物中的表达。


13.权利要求12的方法，其中所述筛选的基因是选自以下项的一种或多种基因：
fabF(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II)；
yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；
xapR(xapAB的转录激活因子)；
cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；
fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；
mqo(苹果酸脱氢酶)；
yfiD(丙酮酸甲酸裂解酶亚基)；
fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRNA(fMet)N-甲酰基转移酶)；
pyrF(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)；
araA(L-阿拉伯糖异构酶)；
fadR(fad调节子的负调节因子和fabA的正调节因子)；
pabA(氨基脱氧分支酸合酶，亚基II)；
purB(腺苷酸琥珀酸裂解酶)；和
hycI(参与加工HycE的C末端的蛋白酶)，
并且减少所述基因的表达。


14.权利要求12的方法，其中所述微生物是选自以下项的微生物：大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、凝聚杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。


15.一种具有增加的丙二酰-CoA产生能力的重组微生物，其中选自以下基因的一种或多种基因：
fabF(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶II)；
yfcY(β-酮酰-CoA硫解酶)；
xapR(xapAB的转录激活因子)；
cytR(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupC和nupG的转录阻遏物)；
fabH(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶III)；
mqo(苹果酸脱氢酶)；
yfiD(丙酮酸甲酸裂解酶亚基)；
fmt(10-甲酰基四氢叶酸：L-甲硫氨酰基-tRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李相烨，梁东秀，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR