本发明专利技术提供了一种Taq DNA聚合酶活性测定方法，所述方法包括如下步骤：(1)以不同浓度lambda为标准品加入核酸染料，记录荧光值，得到lambda标准品浓度与荧光值的标准曲线；(2)记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光值，计算聚合反应新生成的双链DNA量；(3)绘制同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系曲线；(4)Taq DNA聚合酶原酶活性计算。通过对同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系的推演，计算得到Taq DNA聚合酶活性，本发明专利技术的方法测定精确、反应快速、重复性好。
A method for the determination of Taq DNA polymerase activity
【技术实现步骤摘要】
一种TaqDNA聚合酶活性测定方法
本专利技术属于生物化学领域，涉及一种TaqDNA聚合酶活性测定方法。
技术介绍
TaqDNA聚合酶活性测定方法，如简便的普通PCR测定方法，即以对已知酶活和待测酶活的TaqDNA聚合酶进行倍比稀释，对同一模板进行扩增，检测扩增条带的灰度值，与已知酶活的对标品进行比较，进而计算出待测酶活的活性，该方法测定得到的酶活偏差较大，酶浓度偏差可高达2倍以上。此外，国标给出的酶活测定和计算方法，即以lambdaDNA为标准品绘制标准曲线，对待测酶活的TaqDNA聚合酶进行倍比稀释，进行PCR延伸，取延伸第8min对应的净荧光值，以此时的荧光值反推dNTP消耗量，从而计算酶活性，该方法测定酶活对数据准确定要求非常高，计算酶活有效数据点1-4个，极易导致因实验误差而无法计算出原酶活性或原酶活性计算偏差较大。CN106987643A公开了一种TaqDNA聚合酶活性检测方法，该方法包括模板和引物的设计，PCR反应体系的配制、PCR反应条件的设置和TaqDNA聚合酶活性的准确计算。但该方法给出的公式间接的限定了每一步获得数据的范围，当数据落在有效范围内，可以进行精确的计算，若数据未在有效范围内，则酶活计算失败，该方法计算酶活性的成功率太低。因此，需要提供一种操作简便，数据分析准确的TaqDNA聚合酶活性测定方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种TaqDNA聚合酶活性测定方法，通过对同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系的推演，计算得到TaqDNA聚合酶活性，本专利技术的方法测定精确、反应快速、重复性好。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种TaqDNA聚合酶活性测定方法，所述方法包括如下步骤：(1)以不同浓度lambdaDNA为标准品加入核酸染料，记录荧光值，得到lambdaDNA标准品浓度与净荧光值的标准曲线；(2)记录不同稀释倍数的TaqDNA聚合酶在不同时间点和不同模板浓度下得到的净荧光值，计算聚合反应新生成的双链DNA量；(3)绘制同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系曲线；(4)TaqDNA聚合酶原酶活性计算。国标方法中对中间数据的高精度要求往往导致结果不稳定，无法测定酶活或误差较大，本专利技术通过增加数据监测点，扩大数据选择范围，配合严谨的逻辑推演，使得测定TaqDNA聚合酶活性的方法结果准确，反应快速，重复性好。优选地，步骤(2)所述模板的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术中模板为发夹型寡核苷酸，具体序列如SEQIDNO.1所示：5’-atgcaatcctgagaggacattagggACGAGCGGCGCCGGctatgcCCGGCGCCGCTCGT-3’.优选地，步骤(1)所述lambda标准品的浓度分别为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL和0.390625μg/mL。优选地，步骤(1)所述核酸染料包括PicoGreen饱和核酸染料。优选地，步骤(2)具体包括如下步骤：使用酶稀释缓冲液对待测TaqDNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液，然后进行PCR延伸，记录不同稀释倍数的TaqDNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光均值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算相应的新生成的双链DNA量。优选地，所述PCR延伸的反应体系包括10×PCR缓冲液、MgCl2、模板、dNTP、核酸染料和TaqDNA聚合酶。优选地，所述MgCl2的终浓度为2.0-3.0mM，例如可以是2.0mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM或3.0mM，优选为2.5mM。优选地，所述模板的终浓度为1.125-1.5μM，例如可以是1.125μM、1.25μM、1.375μM或1.5μM，优选为1.25μM。以最优终浓度的配置方法为例，对T2干粉(即模板)加入溶解液溶解，母液浓度为100μM，加入0.25μl，反应体系终浓度为1.25μM。优选地，所述酶稀释缓冲液包括10mM的Tris-HCl，0.1mM的EDTA·2Na，1mM的DTT和50％(v/v)甘油；。优选地，所述酶稀释缓冲液的pH值为8.5。优选地，步骤(3)具体包括如下步骤：根据步骤(2)所得不同稀释倍数的TaqDNA聚合酶在不同时间点计算得到的新生成的双链DNA量，绘制同一时间点下，以1/酶稀释倍数为横坐标，以合成产物量为纵坐标，得到线性关系曲线1，曲线1斜率即为合成产物量与1/酶稀释倍数的比值，即合成产物量与酶稀释倍数的乘积。优选地，步骤(4)具体包括如下步骤：根据步骤(3)中不同时间点下，合成产物量与酶稀释倍数的乘积作为纵坐标，以不同时间点为横坐标，得到线性关系曲线2，所述曲线2的斜率即为合成产物量×酶稀释倍数与不同时间点的比值，原酶活性＝酶活性×反应体系体积/原酶液体积。优选地，所述方法具体包括如下步骤：(1)以100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL和0.390625μg/mL浓度的lambdaDNA为标准品加入PicoGreen饱和核酸染料，记录荧光值，得到lambdaDNA标准品浓度与荧光值的标准曲线；(2)使用酶稀释缓冲液对待测TaqDNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液，然后进行PCR延伸，记录不同稀释倍数的TaqDNA聚合酶在不同时间点得到的净荧光均值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算相应的新生成的双链DNA量；(3)步骤(3)具体包括如下步骤：根据步骤(2)所得不同稀释倍数的TaqDNA聚合酶在不同时间点计算得到的新生成的双链DNA量，绘制同一时间点下，以1/酶稀释倍数为横坐标，以合成产物量为纵坐标，得到线性关系曲线1，曲线1斜率即为合成产物量与1/酶稀释倍数的比值，即合成产物量与酶稀释倍数的乘积；(4)根据步骤(3)中不同时间点下，合成产物量与酶稀释倍数的乘积作为纵坐标，以不同时间点为横坐标，得到线性关系曲线2，所述曲线2的斜率即为合成产物量×酶稀释倍数与不同时间点的比值，原酶活性＝酶活性×反应体系体积/原酶液体积。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术的测定TaqDNA聚合酶活性的方法精确，反应快速，结果稳定，对中间数据的要求较低，降低对操作人员以及检测仪器精度的要求。通过严谨的公式推导演算，确定Taq酶活性测定国标方法中的问题，提高模板用量，使扩增出现平台期的荧光值反映实际的酶活值，提高检测结果的准确性。附图说明图1为实施例中lambdaDNA标准品浓度与荧光值的标准曲线；图2为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Taq DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)以不同浓度lambda DNA为标准品加入核酸染料，记录荧光值，得到lambda DNA标准品浓度与净荧光值的标准曲线；/n(2)记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光值，计算聚合反应新生成的双链DNA量；/n(3)绘制同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系曲线；/n(4)Taq DNA聚合酶原酶活性计算。/n
【技术特征摘要】
1.一种TaqDNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以不同浓度lambdaDNA为标准品加入核酸染料，记录荧光值，得到lambdaDNA标准品浓度与净荧光值的标准曲线；
(2)记录不同稀释倍数的TaqDNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光值，计算聚合反应新生成的双链DNA量；
(3)绘制同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系曲线；
(4)TaqDNA聚合酶原酶活性计算。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述模板的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述lambda标准品的浓度分别为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL和0.390625μg/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸染料包括PicoGreen饱和核酸染料。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体包括如下步骤：使用酶稀释缓冲液对待测TaqDNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液，然后进行PCR延伸，记录不同稀释倍数的TaqDNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光均值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算相应的新生成的双链DNA量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR延伸的反应体系包括10×PCR缓冲液、MgCl2、模板、dNTP、核酸染料和TaqDNA聚合酶；
优选地，所述MgCl2的终浓度为2.0-3.0mM，优选为2.5mM；
优选地，所述模板的终浓度为1.125-1.5μM，优选为1.25μM。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酶稀释缓冲液包括10mM的Tris-HCl，0.1mM的EDTA·2Na，1mM的DTT和50％(v/v)甘油；
优选地，所述酶稀释缓冲液的pH值为8.5。
【专利技术属性】
技术研发人员：张坤晓，聂尚海，燕东平，
申请(专利权)人：莫纳武汉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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