一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种L‑苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，属于生物化学和酶工程领域。本发明专利技术取乙醛及乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD

A high throughput and rapid screening method for L-threonine transaldylase mutants

【技术实现步骤摘要】
一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法
本专利技术属于生物化学和酶工程领域，具体涉及一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法。
技术介绍
L-苏氨酸转醛酶(LTTA)为丝氨酸羟甲基转移酶家族蛋白，能不对称催化对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸是合成β-氨基醇类抗生素甲砜霉素和氟苯尼考的关键手性中间体，近年来，氟苯尼考的需求日益增加，位列10大出口药物之一。目前已报道的LTTA催化效率低(最大转化底物浓度仅为20mM)，达不到工业化生产的要求。天然酶普遍存在立体/区域选择性差、底物谱窄、催化效率低等问题，严重阻碍了生物催化剂的应用，通过分子改造提高酶的稳定性、催化活性及选择性是目前常用的手段。但天然酶的改造或构建新的非天然酶，需要对构建的人工突变体库进行高通量定向筛选以获得性能优异的突变酶。现有技术筛选突变的LTTA主要通过将筛选对象即突变的LTTA作为合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的催化剂，通过检测(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的含量筛选LTTA突变体。现有技术检测(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸主要是通过高效液相色谱(HPLC)或核磁共振的方法，操作费时费力，效率低，不适用于LTTA突变体的高通量快速筛选。
技术实现思路
针对现有技术筛选L-苏氨酸转醛酶突变体操作费时费力，效率低，不适用于L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选的问题，本专利技术提供了一种L-苏氨酸转醛酶(LTTA)突变体的高通量快速筛选方法，具体如下：一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，通过如下步骤筛选：步骤一、配制试剂从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，配制L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；取对甲砜基苯甲醛，L-苏氨酸，磷酸吡哆醛配制转醛反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；取乙醇脱氢酶母液，还原型辅酶Ⅰ母液，配制乙醇脱氢酶反应液，用于(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸合成后乙醛还原成乙醇的反应；步骤二、乙醛标准曲线的绘制取乙醛及乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD340nm下降的平均反应速率VOD340nm，以乙醛浓度为自变量x，VOD340nm为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax，a为所得斜率；步骤三、L-苏氨酸转醛酶突变体酶活性测定转醛反应液、L-苏氨酸转醛酶突变体全细胞反应液，充分混匀、反应结束后，离心除去细胞沉淀，收集反应上清液，反应上清液根据产物乙醛的浓度进行相应倍数n稀释，使得乙醛的浓度在0-10mM之间；取上清液和乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD340nm下降的平均速率VOD340nm；步骤四、筛选通过VOD340nm计算得到反应液中乙醛的浓度，C(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸＝C(乙醛)＝VOD340nm/a×n，通过对乙醛浓度的判断从而对L-苏氨酸转醛酶突变体的催化活性进行快速筛选，即以乙醛浓度的高低来筛选相应活性高低的L-苏氨酸转醛酶突变体。进一步的，所述L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液的配制具体为：从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，接种到48孔0.3mLLB液体培养基且含50μg/mL卡那霉素的深孔板中，37℃，180rpm过夜培养；第二天吸取50μL细胞培养液转接到另一个48孔含950μLLB液体培养基且含50μg/mL卡那霉素的深孔板中，37℃，200rpm振荡培养2-3h；加入IPTG至终浓度为0.1mM，30℃诱导8h后停止培养；在4℃条件下4000rpm离心10min，离心收集BL21(DE3)菌体，加入100μL、100mM、pH7.0的Tris-HCl缓冲液重悬，-80℃保存。进一步的，所述转醛反应液的配制具体为：称取0.184g、1mM的对甲砜基苯甲醛，0.238g、2mM的L-苏氨酸，6.1mg、25μM磷酸吡哆醛，用100mM，pH7.0的Tris-HCl缓冲液定容到100mL，现配现用。进一步的，所述对甲砜基苯甲醛事先加热溶解于10mL乙腈。进一步的，所述乙醇脱氢酶反应液的配制具体为：取100μL、5000U/mL的乙醇脱氢酶母液，100μL、15mg/mL的NADH母液，用100mM，pH7.0的Tris-HCl缓冲液定容至10mL，2～6℃保存，现配现用。进一步的，所述乙醛标准曲线的绘制具体为：取40％乙醛母液，分别稀释配制0、1、2、4、6、8、10mM乙醛工作溶液；在96孔板中加入20μL乙醛工作液，180μL乙醇脱氢酶反应液，马上置于酶标仪中检测OD340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD340nm下降的平均反应速率VOD340nm；以乙醛浓度为自变量x，VOD340nm为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax。本专利技术采用高通量筛选方法High-ThroughputScreeningmethod(简称HTS)的原理如下所示：LTTA催化的特征之一是反应过程中产生等物质量的β-羟基-α-氨基酸和乙醛，因此通过检测反应液中乙醛的含量变化可以表征LTTA的催化活性。本专利技术利用乙醇脱氢酶ADH能够特异性地将乙醛还原成乙醇，同时将NADH转化成NAD+。NADH在OD340nm有最大吸收峰而NAD+在该波长下没有吸收峰，因此通过检测单位时间内OD340nm下降的快慢对反应过程中产物乙醛的含量进行表征，从而对LTTA突变体的催化活性进行快速检测。本专利技术每分钟能高通量快速筛选LTTA突变体96个，大大优于传统的HPLC检测(4个样品/小时)，能够快速筛选高产(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的LTTA突变体；同时本专利技术不受反应液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，操作简便，便于推广应用。附图说明图1为乙醛标准曲线。图2为LTTA突变体催化产生(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的HPLC(OPA/NAC衍生化)检测图谱；图3为分别采用本专利技术高通量筛选方法HTS和现有技术HPLC检测(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸含量的相关性线形图。具体实施方式以下提供本专利技术的优选实施例，以助于进一步理解本专利技术。本领域技术人员应了解到,本专利技术实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本专利技术的方案。步骤一、试剂配制L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液：从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，接种到48孔深孔板(0.3mLLB液体培养基，含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，180rpm过夜培养。第二天吸取50μL细胞培养液转接到另一个48孔深孔板(含950μLLB液体培养基，50μg/mL卡那霉素)中，37℃，200rpm振荡培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：通过如下步骤筛选：/n步骤一、配制试剂/n从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，配制L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；/n取对甲砜基苯甲醛，L-苏氨酸，磷酸吡哆醛配制转醛反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；/n取乙醇脱氢酶母液，还原型辅酶Ⅰ母液，配制乙醇脱氢酶反应液，用于(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸合成后乙醛还原成乙醇的反应；/n步骤二、乙醛标准曲线的绘制/n取乙醛及乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD

【技术特征摘要】
1.一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：通过如下步骤筛选：
步骤一、配制试剂
从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，配制L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；
取对甲砜基苯甲醛，L-苏氨酸，磷酸吡哆醛配制转醛反应液，用于合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸；
取乙醇脱氢酶母液，还原型辅酶Ⅰ母液，配制乙醇脱氢酶反应液，用于(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸合成后乙醛还原成乙醇的反应；
步骤二、乙醛标准曲线的绘制
取乙醛及乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD340nm下降的平均反应速率VOD340nm，以乙醛浓度为自变量x，VOD340nm为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax，a为所得斜率；
步骤三、L-苏氨酸转醛酶突变体酶活性测定
转醛反应液、L-苏氨酸转醛酶突变体全细胞反应液，充分混匀、反应结束后，离心除去细胞沉淀，收集反应上清液，反应上清液根据产物乙醛的浓度进行相应倍数n稀释，使得乙醛的浓度在0-10mM之间；
取上清液和乙醇脱氢酶反应液，随即置于酶标仪中检测OD340nm随时间的变化情况，每2s读取一次，读取30次，计算OD340nm下降的平均速率VOD340nm；
步骤四、筛选
通过VOD340nm计算得到反应液中乙醛的浓度，C(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸＝C(乙醛)＝VOD340nm/a×n，通过对乙醛浓度的判断从而对L-苏氨酸转醛酶突变体的催化活性进行快速筛选，即以乙醛浓度的高低来筛选相应活性高低的L-苏氨酸转醛酶突变体。


2.根据权利要求1所述的一种L-苏氨酸转醛酶突变体的高通量快速筛选方法，其特征在于：所述L-苏氨酸转醛酶全细胞反应液的配制具体为：从L-苏氨酸转醛酶突变库中随机挑取突变体单克隆，接种到48孔0.3mLLB液体培养基且含50...

【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，许炼，王力超，许鑫琦，陈承滔，赖凌燕，
申请(专利权)人：福州大学，福建昌生生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35