一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法技术

本申请涉及一种端粒酶活性检测试剂盒，包括端粒酶底物引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液、量子点分子信标，其中量子点分子信标由寡核苷酸茎环、量子点荧光基团和淬灭基团组成，量子点荧光基团与寡核苷酸茎环的序列的5’端连接，淬灭基团与寡核苷酸茎环的序列的3’端连接，其中量子点荧光基团优选为CdTe:Zn

A detection kit for telomerase activity and a detection method for telomerase activity

【技术实现步骤摘要】
一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法
本专利技术涉及生化检测
，尤其涉及一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法，该方法尤其可用于非诊断治疗目的的端粒酶活性检测。
技术介绍
端粒酶是一种逆转录酶，通过在染色体末端添加重复单位(TTAGGG)n，在维持端粒长度方面发挥重要作用。众所周知，在大多数正常细胞的细胞分裂过程中，端粒逐渐缩短，并且没有可检测到的端粒酶活性。端粒酶表达与肿瘤发生有关，因此端粒酶活性检测也是癌症早期诊断的一个重要标准。已经开发了多种方法来检测端粒酶活性，其中端粒重复序列扩增方案(TRAP)最常用，已成为一种黄金方法。虽然TRAP及其改进的检测方法灵敏度高和特异性好，但这些基于聚合酶链反应(PCR)的方法也存在明显的缺点，如操作复杂、耗时、假阳性、无法原位检测。近年来，荧光方法由于灵敏且简单而备受关注，并且已广泛用于靶标的可视化检测。分子信标(MB)是基于荧光共振能量转移(FRET)的发夹DNA探针。一般地，分子信标由寡核苷酸序列、荧光基团和淬灭基团组成，其中寡核苷酸序列可以形成茎区和环区，环区由18-30个与靶链核苷酸序列互补的碱基组成，茎区由5-7个互补的碱基组成，荧光基团与寡核苷酸序列的5'端连接，淬灭基团与寡核苷酸序列的3'端连接。分子信标在自由状态下，寡核苷酸序列形成茎区和环区，使得荧光基团与淬灭基团靠近，由于FRET效应，荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭，当分子信标的寡核苷酸序列与链核苷酸序列杂交时，分子信标的寡核苷酸序列的茎区和环区被打开，使得荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团发出的荧光不被淬灭，从而显现出来而可以被检测。量子点(quantumdots,QD)是一种纳米半导体材料，直径在2-20nm之间。由于量子点的电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。与传统荧光染料相比，量子点作为分子信标的荧光基团具有许多优点，如具有光化学稳定性、生物兼容性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的端粒酶检测方法和检测试剂盒，其中采用包含量子点荧光基团的分子信标。因此，在一个方面，本专利技术提供一种端粒酶活性检测试剂盒。该检测试剂盒包括端粒酶底物引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液、量子点分子信标，其中该量子点分子信标由寡核苷酸茎环、量子点荧光基团和淬灭基团组成，该端粒酶底物引物为5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(SEQIDNO:1)，该寡核苷酸茎环的序列为5’-G*G*G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAACCCTAACCCTAACCCTAAAACTCTGCTCCTCTTTAGGGTTAGGG-3’(SEQIDNO:2)，其中*表示硫代磷酸酯键，该量子点荧光基团与该寡核苷酸茎环的序列的5’端连接，该淬灭基团与该寡核苷酸茎环的序列的3’端连接。在本专利技术的实施方案中，该荧光基团可以为CdTe:Zn2+量子点、CdZnTeS量子点或CdTe/Cds量子点。在本专利技术的优选实施方案中，该荧光基团为CdTe:Zn2+量子点。在本专利技术的实施方案中，该淬灭基团可以为BHQ1、BHQ2或BHQ3。在本专利技术的优选实施方案中，该淬灭基团为BHQ2。在本专利技术的优选实施方案中，该端粒酶逆转录缓冲液包含20mMTris-HCl(pH＝8.3),1.5mMMgCl2,63mMKCl,0.005％Tween20,BSA0.1mg/mL。在本专利技术的优选实施方案中，该检测试剂盒还包括Tris缓冲液，该量子点分子信标溶于该Tris缓冲液中形成量子点分子信标溶液。在本专利技术的具体实施方案中，该检测试剂盒包括：第一试剂容器，该第一试剂容器包含该端粒酶底物引物、dNTPs和该端粒酶逆转录缓冲液，第二试剂容器，该第二试剂容器包含该量子点分子信标溶于该Tris缓冲液中形成的该量子点分子信标溶液。在本专利技术的优选实施方案中，该检测试剂盒还包括第三试剂容器，该第三试剂容器包含端粒酶细胞提取物标准品溶液。通常，该检测试剂盒还附有端粒酶活性检测说明书。在另一个方面，本专利技术提供一种用于非诊断治疗目的的体外端粒酶活性检测方法，该方法包括以下步骤：获取待测的端粒酶样品；向该待测的端粒酶样品加入根据权利要求1-6中任一项该的检测试剂盒中的该端粒酶底物引物、dNTPs和端粒酶逆转录缓冲液进行延伸反应，形成端粒酶延伸反应产物；向该端粒酶延伸反应产物加入根据权利要求1-6中任一项该的检测试剂盒中的该量子点分子信标进行杂交反应；检测该杂交反应的荧光，其中荧光的出现指示端粒酶的存在。术语“待测的端粒酶样品”是指任何需要测量其中的端粒酶活性的样品，优选生物样品，例如但不限于组织细胞液、血液、体液、尿液等。该样品的获取方法是本领域公知的，例如将组织或细胞破碎获得组织细胞液，或者通过抽取的方法获得血液、体液或尿液。在又一个方面，本专利技术提供一种用于非诊断治疗目的的细胞内端粒酶活性检测方法，该方法包括以下步骤：获取待测的细胞；将该待测的细胞与根据权利要求1-6中任一项该的检测试剂盒中的该端粒酶底物引物在37℃下孵育，然后与该量子点分子信标孵育；检测该待测的细胞的荧光，其中荧光的出现指示端粒酶的存在。术语“待测的细胞”是指任何需要测量其中的端粒酶活性的细胞，包括正常体细胞，如肾脏细胞、肝脏细胞等，也包括任何癌变或怀疑癌变的肿瘤细胞，如肾脏肿瘤细胞、肝脏肿瘤细胞等。本专利技术中的量子点分子信标可以参考中国专利技术专利申请CN201710509991(一种合成染料修饰DNA功能化含镉量子点的方法及其应用)中公开的方法来制备。简单地讲，可以通过将猝灭基团如BHQ2连接到硫代磷酸酯修饰的5’-G*G*G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAACCCTAACCCTAACCCTAAAACTCTGCTCCTCTTTAGGGTTAGGG-3’(SEQIDNO:2)的3'末端，得到硫代磷酸酯修饰的发夹BHQ2-DNA，然后用该BHQ2-DNA与量子点(如CdTe:Zn2+QD)合成所需原料混合，一步法得到DNA功能化量子点，随后95℃退火5分钟得到本专利技术的量子点分子信标，如量子点分子信标QD-BHQ2。本方法采用一步法合成量子点分子信标QD-BHQ2，无需进一步的功能化修饰，使操作更简单，成本更低廉，量子点分子信标的制备效率更高。本专利技术中的量子点分子信标如QD-BHQ2无需过多的化学修饰，无需进行信号放大，具有优异的生物相容性、荧光恢复、检测灵敏度和光稳定性，并且没有细胞毒性。该量子点分子信标QD-BHQ2在不使用时，发夹BHQ2-DNA使得BHQ2接近CdTe:Zn2+QD纳米颗粒并淬灭后者的荧光。当在通过将端粒酶引物(TS引物)、dNTPs和端粒酶提取物进行孵育得到的端粒酶反应产物体系中加入该量子点分子信标QD-BHQ2时，发夹BHQ2-DNA与端粒酶反应产物杂交而被打开，使得BHQ2远离CdTe:Zn2+QD纳米颗粒而不能淬灭后者的荧光，即CdTe本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括端粒酶底物引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液、量子点分子信标，其中所述量子点分子信标由寡核苷酸茎环、量子点荧光基团和淬灭基团组成，所述端粒酶底物引物为5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’(SEQ ID NO:1)，所述寡核苷酸茎环的序列为5’-G*G*G*G*G*G*G*G*G*G*AA AAA CCC TAA CCC TAA CCC TAAAAC TCT GCT CCT CTT TAG GGT TAG GG-3’(SEQ ID NO:2)，其中*表示硫代磷酸酯键，所述量子点荧光基团与所述寡核苷酸茎环的序列的5’端连接，所述淬灭基团与所述寡核苷酸茎环的序列的3’端连接。/n

【技术特征摘要】
1.一种端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括端粒酶底物引物、dNTPs、端粒酶逆转录缓冲液、量子点分子信标，其中所述量子点分子信标由寡核苷酸茎环、量子点荧光基团和淬灭基团组成，所述端粒酶底物引物为5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(SEQIDNO:1)，所述寡核苷酸茎环的序列为5’-G*G*G*G*G*G*G*G*G*G*AAAAACCCTAACCCTAACCCTAAAACTCTGCTCCTCTTTAGGGTTAGGG-3’(SEQIDNO:2)，其中*表示硫代磷酸酯键，所述量子点荧光基团与所述寡核苷酸茎环的序列的5’端连接，所述淬灭基团与所述寡核苷酸茎环的序列的3’端连接。


2.根据权利要求1所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为CdTe:Zn2+量子点、CdZnTeS量子点或CdTe/Cds量子点，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。


3.根据权利要求2所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为CdTe:Zn2+量子点，所述淬灭基团为BHQ2。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述端粒酶逆转录缓冲液包含20mMTris-HCl(pH＝8.3),1.5mMMgCl2,63mMKCl,0.005％Tween20,BSA0.1mg/mL。


5.根据权利要求4所述的端粒酶活性检测试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马英新，黄卫人，钟玉城，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44