一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。该方法以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，形成检测微单元，然后将负载酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上形成葡萄糖检测试纸条，对葡萄糖进行检测。本发明专利技术制备简单，反应条件温和，可以实现随时随地快速高效检测，并且价格低廉，使用安全，对临床葡萄糖监测和疾病诊断有重要指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法
本专利技术涉及医学体外诊断
，具体涉及一种利用巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。
技术介绍
葡萄糖是自然界中最为重要且分布最广的一种单糖，化学式为C6H12O6，是多羟基醛的一种，是人体内各组织细胞活动所需的物质。血糖是指血液中葡萄糖，尿糖是指尿液中葡萄糖，人体内的血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在空腹血糖浓度为3.9-6.0mmol/L，其受饮食、神经系统、激素等影响，当出现不平衡时，会出现血糖升高或降低，空腹血糖浓度超过6.0mmol/L称为高血糖，血糖浓度低于3.9mmol/L称为低血糖。糖尿病是一种常见的内分泌疾病，是由于人体内胰岛素分泌绝对或相对不足以及机体靶细胞对胰岛素敏感性降低而引起的血中糖、脂肪、蛋白质等一系列代谢紊乱综合征，其主要特点是高血糖。随着我国人口老龄化趋势以及生活习惯、饮食结构的改变，糖尿病的发病率明显升高，长期的糖代谢紊乱会引起多器官、多系统的损害，如心、肾、眼、神经等。葡萄糖是临床生化检验中的重要指标，可以为糖尿病、高血压以及心脑血管系统等疾病的诊断、治疗用药、病情监测以及疾病预防等方面提供客观依据。因此，坚持定期检测血糖和尿糖对糖尿病的治疗有极其重要的意义。目前，血清中葡萄糖的检测方法主要有：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、葡萄糖脱氢酶法、电极法、干化学法、气相色谱一同位素稀释质谱法以及无创血糖测量法等。尿糖的检测方式主要包括班氏法检测、费氏法检测、葡萄糖氧化酶试纸法检测、尿液干化学分析仪检测等。己糖激酶方法多见于自动生化分析仪，但从红细胞中释放出的有机磷酸酯和一些酶会消耗NADP，使结果产生偏差，并且价格偏高，临床应用受到限制。葡萄糖脱氢酶法会受到己糖、木糖等其他糖类的干扰而导致测试者血糖值假性偏高。电极法方法简便迅速，标本用量较少，且特异性、灵敏度、精密度、准确性均较高，但需要专业设备，适合在医院等机构使用，不适合居家使用。干化学法快速简便，主要用于急诊。班氏法能够了解患者尿液中糖分类型，但是对病情较低的糖尿病患者无诊断意义，并且需要较长的反应时间，容易受其他因素的干扰，从而出现漏诊或误诊的现象。尿液干化学分析仪检测法是一种现代化的尿糖检测方式，该检查方式具有快捷、准确率高等特点，但是该检测方式会受到温度、尿液中过氧化氢的含量等多方面内的影响，并且该方法的成本较高，无法在基层医院里推广使用。葡萄糖氧化酶法的基本原理是：β-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下，被氧化生成过氧化氢，在过氧化氢酶的催化下能使发光底物发出光信号，此方法操作简便，性能较好，用量少，成本低，受糖类还原物质的影响小，广泛用于临床，是卫生部推荐的血糖测定的常规方法，但抗干扰能力稍差，反应条件高，无法回收继续利用，因此考虑采用酶固化的方法，将葡萄糖氧化酶固定在基底上进行检测，可以提高酶的稳定性并且降低使用成本。中国专利CN102199592A【一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法】介绍了一种制备共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球的方法，以壳聚糖-精氨酸阴离子微球为载体固定葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶对β-D-葡萄糖进行检测，是对β-D-葡萄糖检测体系进行的有益尝试和补充，但其制备流程复杂，会受到共存的其他组份的干扰，从而影响测定结果，此外其吸光度变化小，灵敏度较低，需要进一步改进。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种巯丙基琼脂糖球负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶检测葡萄糖的方法。目的在于提供一种能够简单快速实时检测葡萄糖的方法，方便检测者在家中自行检测，省去多次跑医院的繁琐流程，同时固定葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的研究相对较少，过氧化氢酶的加入，不仅能够减轻葡萄糖氧化分解过程中产生的H2O2对酶的损伤，而且可以改变酶氧化的微环境，提高葡萄糖氧化酶酶活力。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：首先，本专利技术提供一种葡萄糖检测试纸及其制备方法。本专利技术所提供的葡萄糖检测试纸通过包括如下步骤的方法制备得到：1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，得到负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；2)将所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球(检测微单元)固定在试纸上，得到葡萄糖检测试纸。上述方法步骤1)中，所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与葡萄糖氧化酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液；用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液，反应，得到负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。其中，步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球具体可为6B；所述巯丙基琼脂糖球为干燥的巯丙基琼脂糖球；尺寸范围可为45-165微米，平均尺寸大小可为90微米；所述水具体可为双蒸水；所述巯丙基琼脂糖球与水的配比可为：1ml:3ml-1ml:10ml，具体可为1mL:10mL；所述浸泡可为浸泡过夜；浸泡后巯丙基琼脂糖球的体积大概是干燥状态下体积的3倍；所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)为三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液；所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中TCEP的浓度可为0.01-10mM，具体可为0.1mM，所用溶剂可为10mMTris-HCl(pH8.0)溶液；所述二硫苏糖醇(DTT)为二硫苏糖醇(DTT)溶液；所述二硫苏糖醇(DTT)溶液中DTT的浓度可为1-100mM，所用溶剂可为10mMTris-HCl(pH8.0)溶液；所述葡萄糖氧化酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中葡萄糖氧化酶的酶活为100—250units/mg；所用溶剂可为10mMPBS(pH7.4)，所述过氧化氢酶溶液的浓度可为1-1000μg/ml，具体可为50μg/ml，其中过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg；所用溶剂可为10mMPBS(pH7.4)；所述反应的温度均为室温，时间均为5min-2h小时，具体可为1小时。在进行(2)的操作前，还包括将所述TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球用缓冲液洗涤，去除多余的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备葡萄糖检测试纸的方法，包括如下步骤：/n1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，得到负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；/n2)将所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上，得到葡萄糖检测试纸。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备葡萄糖检测试纸的方法，包括如下步骤：
1)以巯丙基琼脂糖球为载体，通过化学反应在巯丙基琼脂糖球的表面和内部负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，得到负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球，即检测微单元；
2)将所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球固定在试纸上，得到葡萄糖检测试纸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述负载有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球通过包括如下步骤的方法制备得到：
(1)用水浸泡巯丙基琼脂糖球使其吸水膨胀，用三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇(DTT)与吸水膨胀后的巯丙基琼脂糖球反应，得到TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球；用TCEP或者DTT与葡萄糖氧化酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液；用TCEP或者DTT与过氧化氢酶溶液反应，得到TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液；
(2)向TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液，反应，得到负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球，向得到的负载有葡萄糖氧化酶的巯丙基琼脂糖球中加入TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液，反应，得到负载葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的巯丙基琼脂糖球。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述巯丙基琼脂糖球为Thiopropyl6B；尺寸范围为45-165微米，平均尺寸为90微米；
步骤(2)中，TCEP或DTT处理过的激活的巯丙基琼脂糖球的巯丙基琼脂糖球与TCEP或DTT处理过的葡萄糖氧化酶溶液中的葡萄糖氧化酶、TCEP或DTT处理过的过氧化氢酶溶液中的过氧化氢酶的配比依次为：200μL：1-1000μg：1-1000μg；
葡萄糖氧化酶的酶活为100—250units/mg；
过氧化氢酶的酶活为≥250units/mg。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述试纸为：玻璃纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：马岚，薛超文，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44