一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，包括以下试剂：ATP、ABL1底物多肽、反应缓冲液，以及ABL1蛋白或ABL1激酶结构域(PTK)对应的多肽片段。本发明专利技术ABL1激酶活性检测试剂盒操作简便、有效，可以在细胞外高通量地检测ABL1激酶的活性，从而用于大规模地筛选ABL1激酶活性的抑制剂。

A kit for the detection of extracellular abl1 kinase activity and its application

【技术实现步骤摘要】
一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及酶活性检测
，尤其是一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒。
技术介绍
非受体酪氨酸激酶ABL1广泛存在于哺乳动物各种组织细胞中，通过介导底物蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰，参与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、炎症反应、肿瘤发生形成等生命过程的调控。在正常生理条件下，ABL1的激酶活性受到严谨调控，被多种细胞因子、氧化应激或DNA损伤应激激活后的ABL1激酶活性大大提高，通过定位于不同的细胞亚结构发挥不同的生理功能。BCR-ABL融合蛋白在细胞信号转导以及转化过程中通过不断磷酸化和活化下游底物，促使各阶段粒细胞无限增殖和迁移，最终导致细胞生长失控，引发白血病。以它作为靶点来进行研究，使靶向治疗CML(慢性髓性白血病)显得非常有意义。ABL蛋白是由几个结构域共同组成的一个非受体型酪氨酸激酶，它包括N端结构域(NCap)、SH2结构域、SH3结构域、一段连接序列和C末端的激酶结构域(PTK)，正是其中这段激酶结构域使得ABL蛋白具有酪氨酸激酶的活性。完整的ABL1蛋白较大，表达较为困难。患者体内ABL1蛋白发生的一些突变使得CML的治疗变得有些困难。目前已开发出一些基于ABL1蛋白的抑制剂，包括伊马替尼(imatinib)，尼洛替尼(nilotinib)，博舒替尼(bosutinib)等，均对ABL1蛋白有很好的抑制作用，但由于蛋白一些位点的突变，使得部分患者产生耐受现象。另一方面，在体内的研究中往往周期长，而且体内生物环境的复杂性也为ABL1抑制剂的研发设置了巨大的阻碍。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术提供了一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，其可以用于高通量、大规模地筛选ABL1激酶的活性抑制剂。为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，包括以下试剂：ATP、ABL1底物多肽、反应缓冲液，以及ABL1蛋白或ABL1激酶结构域(PTK)对应的多肽片段。作为上述方案的进一步优化，所述ABL1底物多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。作为上述方案的进一步优化，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段为PTK的全部或部分。需要说明的是，ABL蛋白是由几个结构域共同组成的一个非受体型酪氨酸激酶，它包括N端结构域(NCap)、SH2结构域、SH3结构域、一段连接序列和C末端的激酶结构域(PTK)，其中正是这段激酶结构域(PTK)使得ABL蛋白具有酪氨酸激酶的活性，由于ABL1整个蛋白较大，表达较为困难，因此，本专利技术的检测试剂盒可以选择PTK结构域相应的多肽，但是不限于PTK结构域相应的多肽，还可以选择包括PTK结构域以及其相邻的结构域的多肽片段，或者是整个ABL1蛋白。作为上述方案的进一步优化，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。需要说明的是，本专利技术经多次实验证实，采用如SEQIDNO.2或3所示的多肽用于筛选ABL1激酶的活性抑制剂都是有效的。作为上述方案的进一步优化，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。需要说明的是，本专利技术的试剂盒可以选择SEQIDNO.2所示的多肽，或SEQIDNO.3所示的多肽，还可以同时选择SEQIDNO.2和3所示的多肽。作为上述方案的进一步优化，所述反应缓冲液包括HEPES、MgCl2、DTT和BSA。作为上述方案的进一步优化，所述HEPES的浓度为50mmol/L，所述的浓度为10mmol/L，所述DTT的浓度为2mmol/L，所述BSA的浓度为0.1％(W/W)。作为上述方案的进一步优化，所述HEPES的pH为7.3。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了上述试剂盒在筛选ABL1的活性抑制剂中应用。作为本专利技术的又一个方面，本专利技术还提供了一种ABL1激酶的活性抑制剂，所述抑制剂为小檗碱。综上所述，本专利技术的有益效果为：本专利技术ABL1激酶活性检测试剂盒操作简便、有效，可以在细胞外高通量地检测ABL1激酶的活性，从而用于大规模地筛选ABL1激酶活性的抑制剂。附图说明图1是ABL1激酶反应原理示意图；图2是本专利技术的ABL1激酶活性检测试剂盒的检测原理示意图；图3是SDS-PAGE实验结果图；图4是小檗碱抑制ABL1激酶活性的标准曲线；图5是采用ABL1蛋白片段序列1检测小檗碱抑制ABL1激酶活性的结果图；图6是采用ABL1蛋白片段序列2检测小檗碱抑制ABL1激酶活性的结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种体外的ABL1激酶活性检测方法和试剂盒，其可以用于高通量，大规模的筛选ABL1活性的抑制剂。本专利技术的ABL1激酶活性检测试剂盒涉及以下反应原理：如图1所示，ABL1能催化ATP上的磷酸基转移到许多重要的蛋白质酪氨酸残基上，使其残基磷酸化，从而激活底物，通过一系列反应影响细胞的生长、增殖和分化。激酶反应发生时，可以使ATP转变为ADP，这样就可以根据ATP的减少量来定量ABL1激酶的活性。如图2所示，Luciferin和ATP反应后，在氧气的催化下和底物(luciferase)反应，产生荧光，通过检测荧光就可以检测ATP的含量。为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。如无特别说明，本专利技术中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本专利技术中的试剂浓度均为质量浓度；如无特别说明，本专利技术中的试剂、材料、细胞等均可从市场上或其它公开渠道获得。实施例1本专利技术的细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒的一种实施例，包括以下组分：(1)ATP；(2)ABL1底物多肽，其氨基酸序列为：EAIYAAPFAKKK(SEQIDNO.1)；(3)ABL1蛋白片段序列1，其氨基酸序列如下：EYLLSSGINGSFLVERSESSPGQRSISLRYEGRVYHYRINTASDGKLVSSESRFNTLAELVHHHSTVADGLITTLHYPAPKRNKPTVYGVSPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGVWKKYSLTVAVKTLKEDTMEVDDFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIITEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRMTGDTYTAHAGAKFPIKWTAPESLAYNKFSIKSDVWAFGVLLWEIATYGMSPYPGIDLSQVYELLEKDYRMERRPEGCPEKVYELMRACWQWNPSDRPSFAEIHQAFETMFQESSISDEVEKELGKQGVRGAVSTLLQAPELPTKTRSRRAAEHRDTTDVPEMPHSK(SEQIDNO.2)；(4)AB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：ATP、ABL1底物多肽、反应缓冲液，以及ABL1蛋白或ABL1激酶结构域(PTK)对应的多肽片段。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞外ABL1激酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：ATP、ABL1底物多肽、反应缓冲液，以及ABL1蛋白或ABL1激酶结构域(PTK)对应的多肽片段。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1底物多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段为PTK的全部或部分。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1激酶结构域对应的多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ABL1激酶结构域对应的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：费嘉，阴钊，
申请(专利权)人：广州安镝声生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44